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Isolation and Characterization of Bacteria Producing Substances Against Gram Pos

Isolation and Characterization of Bacteria Producing Substances Against Gram Positive Bacteria. 報告學生：鄭燕如 張如慧 報告日期： 2003/12/29. 前言 I. 在世界各地，從醫院內部感染的個案中，革蘭氏陽性細菌，是引起醫院內部感染的最大來源。 人類疾病中，多為革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陽性桿菌。. 前言 II.

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Isolation and Characterization of Bacteria Producing Substances Against Gram Pos

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Presentation Transcript

  1. Isolation and Characterization of Bacteria Producing Substances Against Gram Positive Bacteria 報告學生：鄭燕如 張如慧 報告日期：2003/12/29

  2. 前言 I • 在世界各地，從醫院內部感染的個案中，革蘭氏陽性細菌，是引起醫院內部感染的最大來源。 • 人類疾病中，多為革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陽性桿菌。

  3. 前言 II • 革蘭氏陽性桿菌在一般人體正常菌叢中較不常見，但其所具有的致病毒性卻相當強，會引起一些致命的疾病，如白喉（由白喉桿菌所引起）或敗血病及細菌性腦膜炎（列氏桿菌屬）。 • 要治療這些疾病，就必須抑制這類病原菌的生長。

  4. 前言III • 利用微生物代謝物中的某些物質（抗生素），來殺死其他微生物或抑制其他微生物繁殖，作用機轉可分為: 1.抑制細胞壁的合成 2.破壞細胞膜 3.抑制蛋白質的合成 4.影響它的去氧核糖核酸的合成

  5. 目的 自土壤中分離出會利用代謝產物來抑制革蘭氏陽性菌（gram positive）的細菌

  6. 材料I • 第四組及淡水的土樣 • 革蘭氏陽性菌株 Bacillus cereus Staphylococcus aureus subsp. aureus • 9mL 0.85% NaCl、100 ppm cycloheximide • 2,5,7,10%NaCl • glucose、xylose、mannitol、lactose、fructose、arabinose

  7. 材料II • Citrate • Urea broth • MacConkey agar • Mannitol Salt Agar • SIM agar • Voges-Proskauer • 1/3TSA

  8. 實驗流程 自土壤中分離出菌株做純培養 ↓ 與革蘭氏陽性菌做拮抗測試 ↓ 挑選出具有拮抗作用的菌株 ↓ 利用傳統方法進行菌株的鑑定

  9. 實驗流程-I<分離土壤中的細菌> 1g土樣+9mL 0.85% NaCl 連續稀釋至104 ↓ 取稀釋度103、104 0.1mL塗抹於含100ppm cycloheximide的1/3TSA(二重複) ↓ 30℃ ‚培養 ↓ 待菌落長出‚四區畫線純培養於1/3TSA上

  10. 篩到的菌株 ↓ 將革蘭氏陽性菌利用無菌棉棒接種到0.85% NaCl 中‚再塗抹至1/3TSA plate上 ↓ 利用loop將分離出來的細菌接種到已塗有革蘭氏陽性菌的plate上 ↓ 培養30℃、一天，觀察拮抗現象 a1 a2 a3 a4 實驗流程-II<拮抗作用實驗>

  11. 實驗流程-III<傳統生化測試> • Gram stain • Spore stain • Carbohydrate fermentation • 2,5,7,10%NaCl • Citrate uilization test • Urease test • MacConkey agar • Mannitol Salt Agar

  12. 實驗流程-IV<傳統生化測試> • Nitrate reduction test • Catalase test • Oxidase test • Voges-Proskauer test • Indole production test • Triple sugar-iron agar test • SIM agar

  13. 結果與討論I • 篩出五株菌對所測試的Bacilluscereus和Staphylococcusaureus subsp. aureus皆具有拮抗作用‚編號為a3 ‚ a6 ‚ b1 ‚ b2及d3 • 此五株菌在醣類發酵的測試中皆沒有氣體的產生‚故推論不是兼性厭氧的菌。

  14. 結果與討論II • 由革蘭氏染色得知a3與a6為革蘭氏陰性桿菌 ‚ 而b1 ‚ b2與d3為革蘭氏陽性桿菌 。 • 由孢子染色得知b1 ‚ b2與d3具有孢子‚ 但是孢子位置不確定‚ 可能位於細胞中間或細胞頂端。

  15. 結果與討論III • 由表一的生化測試中看到‚a3與a6的生化測試幾乎完全一樣‚只在測其移動性時a3具有明顯的移動性‚而a6則沒有;但其實在觀察時a6感覺具有很不明顯的移動性。(a3與a6請看分類樹一.)

  16. 結果與討論IV • 由生化測試中看出b1、b2、d3皆為產孢的桿菌，且catalase反應皆為正，由此可得知此三株菌皆為Bacillus spp. • 而b1、b2、d3的生化測試中只有glucose發酵測試、citrate、mannitol的結果反應不大相同，其它的生化測試皆相同 （分類樹二）

  17. 分類樹一. G(-) ‚rod且catalase test為正反應 Bdellovibio spp. Azospivillum spp. Halobacterium spp. Acetobacter spp. Legionella spp.

  18. (+) Oxidase 分類樹一. (－) Bdellovibio spp. Azospirillum spp. Halobacterium spp. Legionella spp. Acetobacter spp. Legionella spp. Urease

  19. Bdellovibio spp. Acetobacter spp. Legionella spp 分類樹一 urease （＋） （－） Bdellovibio spp. Azospivillum spp. Halobacterium spp. Acetobacter spp. Glucose fermentation

  20. Bdellovibio spp. 分類樹一 Glucose fermentation H. volcanii H. saccharovorum H.vallismortis Acetobacter paseurianus A. aceti A. liquefocieus A. hansenii

  21. 分類樹一 Nitrate reduction （＋） （－） A. aceti A. liquefocieus H. volcanii H. saccharovorum H.vallismortis 外觀形態

  22. 分類樹一 Pale color A. aceti較無移動性(a6) A. liquefocieus較具移動性(a3) Paink color H. volcanii

  23. Bacillus spp. Sporolactobacillus spp. Clostridum spp. Desulfotomaculum spp. Oscillospira spp. Sporosarcina spp. Planococcus spp. Lactobacillus spp. Kurthia spp. 分類樹二 Endospore-rod （＋） （－）

  24. Bacillus spp. Sporolactobacillus spp. Clostridum spp. Desulfotomaculum spp. Oscillospira spp. 分類樹二 catalase （＋） （－）

  25. B. alcalophilus B. circulans B. lentus B. macerans B. macquarinsis B. marinus B. megaterium B. thuringiensis B. brevis B. globisporus B. sphaericus B. insolitus B. laterosporus B. pantothrnticus B. firmus B. schlegelii B. stearothermophilus 分類樹二 xylose （－） （＋）

  26. B. Megaterium B. Sphaericus B. Stearothermophilus B. thuringiensis B. Brevis B. Insolitus B. Laterosporus B. Marinus 分類樹二 citrate （＋） b1 d3 b2 （－） B. Pantothrnticus B. schlegelii B. sphaericus glucose （－） b1 d3 （＋） glucose （－） b2

  27. B. Megaterium B. Sphaericus B. Stearothermophilus B. thuringiensis B. Insolitus B. schlegelii 分類樹二 glucose glucose b1 d3 b2 （－） （＋） （－） （＋）

  28. 表一. 生化測試-I 測試項目 a3 a6 b1 b2 d3 glucose ＋ ＋ ＋ － － （gas） － － － － － xylose ＋ ＋ － － － （gas） － － － － －2﹪NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 5﹪NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 7﹪NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 10﹪NaCl s s s s － S：長很慢

  29. 表二.生化測試-II 測試項目 a3 a6 b1 b2 d3 citrate ＋ ＋ ＋ － ＋ mannitol － － － ＋ ＋ lactose － － － － － fructose ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ arabinose － － － － － urea broth － － － － －

  30. 表三.生化測試-III 測試項目 a3 a6 b1 b2 d3 MCA ＋ ＋ － － － MSA － － ＋ ＋ ＋ SIM － － － － － （indole） ＋ － － － － TSIA － － ＋ ＋ ＋ VP － － － － － Oxidase ＋ ＋ － － － Catalase ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

  31. Gram stain a3 G(-) a6G(-) b1 G(+) b2 G(+)

  32. Gram stain Spore stain d3 G(+) d3

  33. Spore stain a3 a6

  34. Spore stain b1 b2

  35. MSA test

  36. 參考文獻 • Bergey‘s manual of systematic bacteriology volume 1 • Bergey‘s manual of systematic bacteriology volume 2

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