Purnomo Soeharso Departemen Biologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia

1. Polimorfisme pada promotor gen reseptor FSH wanita usia reproduktif dan pengaruhnya terhadap ekspresi reseptor Purnomo Soeharso Departemen Biologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia

2. Pendahuluan • Program reproduksi berbantuan merupakan suatu pilihan bagi pasangan infertil untuk mendapatkan keturunan. • Stimulasi ovarium dengan FSH merupakan salah satu prosedur standar dalam program reproduksi berbantuan (IVF/ICSI) untuk mendapatkan oosit yang memadai untuk fertilisasi. • Respon wanita usia reproduktif bervariasi terhadap induksi FSH eksogen.

3. Pendahuluan • Variasi respon terhadap FSH eksogen dosis standar terlihat berupa tidak ada respon/respon yang sangat lemah sampai menyebabkan sindrom hiperstimulasi. • Hiperstimulasi dapat menyebabkan komplikasi serius seperti terjadinya pembesaran ovarium dan ekstravasasi cairan ke rongga perut sehingga terjadi ascites, hypovolemia dan perdarahan.

4. Pendahuluan • Hasil studi menunjukkan bahwa genotip reseptor FSH merupakan salah satu faktor penentu respon ovarium terhadap FSH. • Sensitivitas reseptor ditentukan oleh kombinasi alel yang terbentuk.

5. Pendahuluan • Namun karena aktivitas gen tidak terlepas dari aktivitas promotornya, ingin diketahui lebih lanjut apakah daerah promotor gen RFSH juga berperan dalam menentukan sensitivitas ovarium terhadap induksi FSH. • Penelitian pendahuluan menemukan dua polimorfisme pada promotor inti reseptor FSH pada posisi –29 dan –114.

6. Pendahuluan • Penelitian Jiang et al. (1999) pada gen LH menemukan bahwa baik polimorfisme pada gen struktur maupun polimorfisme pada promotor keduanya mempengaruhi fungsi biologi molekul LH. • Penelitian Heckert et al. (1998) melakukan mutagenesis pada promotor reseptor FSH tikus menyebabkan perbedaan ekspresi gen luciferase.

7. Permasalahan penelitian • Apakah benar daerah promotor inti gen reseptor FSH manusia polimorfik? • Apakah polimorfisme pada promotor reseptor FSH mempengaruhi ekspresi gen reseptor FSH? • Bagaimana hubungan polimorfisme promotor reseptor FSH dengan lama hari penyuntikan FSH dan level FSH basal wanita yang mengikuti program IVF/ICSI?

8. Tujuan penelitian • Mendeterminasi polimorfisme pada promotor reseptor FSH wanita usia reproduktif. • Mengkarakterisasi pengaruh polimorfisme pada promotor reseptor FSH terhadap ekspresi reseptor. • Mengetahui hubungan polimorfisme dengan lama penyuntikan FSH dan level basal FSH.

9. Promotor reseptor FSH • Mempunyai tingkat konservasi yang tinggi mulai dari basa –1 s/d –1050 pada beberapa spesies seperti tikus, mencit, manusia, ovine. • Tidak mengandung sekuens TATA dan CCAAT box. • Multiple transcriptional start sites. • Promotor inti RFSH manusia terletak antara –1 dan –225 dan pada tikus antara –1 dan –200.

10. Model skematis daerah 5’ flanking gen RFSH manusia

11. Promotor RFSH • Elemen-elemen regulator penting pada promotor RFSH tikus dan mencit: E box, situs AP-1, Inr, situs E2F, situs GATA, dan SLBS-2 dan SLBS-3. • Elemen regulator pada promotor RFSH manusia: E box (–124 s/d –119) , ERE (–127 s/d –116) dan (–221 s/d –217), dan domain binding (GGAA) untuk faktor transkripsi ETS (–30 s/d –27). • Mutasi pada elemen regulator menurunkan aktivitas promotor.

12. Promotor RFSH • USF1 dan USF2 merupakan faktor transkripsi utama untuk elemen E box pada sel yang mengekspresikan reseptor. • Faktor transkripsi GATA-1 berinteraksi dengan elemen GATA. • Faktor transkripsi SF-1 berinteraksi dengan elemen SLBS-2 dan SLBS-3.

13. Perbandingan sekuens daerah promotor reseptor FSH tikus, mencit, manusia, dan ovine.

14. Model regulasi promotor RFSH tikus dan mencit cAMP PKA SF-1 c-Fos ? USF GATA-1 -2,7 kb ATG SLBS-3 SLBS-2 AP-1 E box Inr E2F GATA

15. Skema kerja di IRM

16. Skema kerja di Bagian Biologi FKUI

17. Hasil amplifikasi daerah promotor inti reseptor FSH manusia (231 bp) ekson 1 intron A -1486 -231 -1 (pb)M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 310 234 231

18. Hasil elektroforesis DNA pada gel SSCP (akrilamid 20%) wt -29 -114 -138 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

19. Elektroferogram hasil sekuensing daerah promotor inti reseptor FSH -29 -29 wt -114 wt -114

20. -123 wt -123 -138 -138 wt

21. 17 poli A 13 poli A

22. Posisi polimorfisme yang ditemukan pada promotor inti reseptor FSH manusia

23. Frekuensi polimorfisme pada wanita Jerman dan Indonesia Persentase polimorfisme Posisi polimorfisme

24. Konstruksi vektor pGL3-basic/promotor inti reseptor FSH

25. Ekspresi relatif (rata-rataSEM) konstruksi pGL3/promotor inti RFSH

26. Grafik hubungan polimorfisme dengan rata-rata hari penyuntikan FSH sampai OPU Rata-rata hari penyuntikan FSH Promotor

27. Grafik hubungan polimorfisme dengan rata-rata level FSH basal Rata-rata level FSH basal Promotor

28. Kesimpulan • Promotor reseptor FSH manusia polimorfik yang dibuktikan dengan ditemukannya empat polimorfisme pada posisi –29, –114, –123, dan –138. Frekuensi tertinggi ditemukan pada posisi –29 (>50%) sedangkan frekuensi ke-3 polimorfisme lainnya sangat rendah ( 0,3%). • Polimorfisme pada posisi –123 menyebabkan penurunan aktivitas promotor sebesar 47,4% relatif dari wt.

29. Kesimpulan • Tidak ditemukan hubungan yang bermakna secara statistik antara polimorfisme posisi –29 dengan rata-rata hari penyuntikan FSH dan level FSH basal.