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Chapter 6 大肠杆菌的克隆载体. 1 以大肠杆菌为基础的克隆载体. 最早使用的三个 “ 天然 ” 的质粒 ---pSC101 、 ColE1 、 RSF2124 。需要进行改造： 删除一些不必要的 DNA 区域 灭活某些质粒的编码基因 加入易于识别的选择性标记 在选择标记基因内引入多克隆位点 加装特殊的基因表达调控元件。. pBR322. plasmid. 代号. Bolivar and Rodriguez (researcher’s initial name or Lab. name etc). 1 以大肠杆菌为基础的质粒.
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1 以大肠杆菌为基础的克隆载体 最早使用的三个“天然”的质粒---pSC101、ColE1、RSF2124。需要进行改造： • 删除一些不必要的DNA区域 • 灭活某些质粒的编码基因 • 加入易于识别的选择性标记 • 在选择标记基因内引入多克隆位点 • 加装特殊的基因表达调控元件。
pBR322 plasmid 代号 Bolivar and Rodriguez (researcher’s initial name or Lab. name etc) 1 以大肠杆菌为基础的质粒 • 最早构建的载体，也是应用最广泛的载体是pBR322 。
1 以大肠杆菌为基础的质粒 • pBR322的优点： • 容易纯化（am/Pst I, Pvu I, Sac I，Tc/BamH I, Hind III) • 较高的转化效率 • 具有可以便利选择的标记基因 • 具有克隆大片段DNA的能力。 • 可以以多拷贝存在
1.2 其它大肠杆菌克隆载体质粒 • pBR327一个多拷贝质粒 • pUC8—Lac 选择质粒 • pGEM3Z-DNA的体外转录载体
1.2 其他的大肠杆菌克隆载体质粒 • pBR327 • 每个细胞中含有30-45个拷贝。 • 剪切破坏了pBR322的接合能力，消除了潜在的危险性。
Other typical E.coli plasmid cloning vectors i. Higher copy number ii. The conjugative ability was lost
1.2 其他的大肠杆菌克隆载体质粒 • pUC8—Lac • 细胞中质粒的拷贝数可达500-700个。 • 重组子的鉴定可一步完成。 • pUC8具多克隆位点。 • 其多克隆位点与M13mp系列载体相同。
Advantages: ◆ MCS ◆ MCS same as M13
1.2 其他的大肠杆菌克隆载体质粒 • pGEM3Z • pGEM3Z与pUC载体结构相似 • 含两段RNA聚合酶的识别位点。 • T7和SP6非常活跃，在整个裂解周期20min内，可以合成1-2ugRNA/min。
(c) pGEM3Z Very similar to pUC MCS RNA synthesis RNA polymerase T7 bacteriophage SP6 phage
2．M13噬菌体为基础的克隆载体 • M13可以提供单链的克隆DNA。 • 正常的M13噬菌体DNA长6.4kb，只能插入507bp的DNA片段。
2.1 载体M13mp2的构建 • 引入lacZ’基因，产生了M13mp1。 • 起始端有GCATTC，通过体外定点突变获得了一个EcoR I位点，产生了M13mp2。第六个密码子由天冬酰胺代替了天冬氨酸。
2.2 M13mp7—对称的克隆位点 合成短的多聚核苷酸polylinker，含一系列的限制性位点和EcoR I粘端，将多聚接头插入到M13mp2的EcoR I位点上，就产生了M13mp7。M13mp7就含有了EcoR I, BamH I，Sal I, Pst I等位点。
2.2 M13mp7—对称的克隆位点 • M13mp7最大优点：具有对称的克隆位点，可通过一种酶将插入片段切下来。
2.3 更复杂M13载体 这些载体有更复杂的多聚接头插入lacZ’基因，可以插入不同粘端的片段。 如M13mp8和M13mp9 。在DNA测序中有重要作用。 成对的载体还有M13mp10/M13mp11，M13mp18/M13mp19 等。
2.4 质粒-M13杂交载体 • M13载体只能插入1500bp的DNA片段，偶尔可插入3kb的片段。
2.4 质粒-M13杂交载体 • 噬菌粒：pEMBL8, 在pUC8中插入了一个1300bp的M13基因组。含有将双链分子转化为单链分子的酶识别位点。 • 可以以质粒的形式复制 • 也可以包装，以噬菌体的方式复制。 • pEMBL8可克隆10kb的DNA片段。
Phagemids(噬粒) —— Hybrid plasmid-M13 vectors
3 以λ噬菌体为基础的克隆载体 • 需要解决的问题： • λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。 • 每种限制性酶具有多个识别位点。
3.1 可切除的λ片段 分子中央有大量可切除的片段，使分子减少为15kb，可以插入18kb的外源分子。 非必需序列包括整合和切下噬菌体的大部分基因。经过修饰的λ基因组可发生裂解循环。
● Segments of theλgenome can be deleted without impairing viability 20~35kb, ‘ non-essential region ’ 0 49 20 35
3.2 限制性位点的缺失 • 一个或2个位点可用体外突变的方法改造。 • 多个位点通过自然选择法改造。 • 自然选择法是用phage侵染能产生EcoR I的E. coli。
Figure 6.15 Using natural selection to isolate λ phage lacking EcoR I restriction sites.
3.3 λ克隆载体 • 插入型载体 改造后的长度为37kb，允许插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb） • 取代型载体 改造后的长度约为40kb，在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），距离为14kb长，可用外源DNA片段取代。其载装下限为10.4而上限为25.5kb。
3.3 λ克隆载体 • 插入型载体 • λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入点位于cI基因内的EcoRI。插入失活鉴定。 • λZAPII，含多聚接头，可插入约10kb DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子。
3.3 λ克隆载体 • 取代型载体 • λWES. λB’，两个 EcoR I位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。 • λEMBL4，可插入20kb的分子，可利用EcoRI、BamHI、SalI替换填充片段。重组子的筛选可以根据片段的大小也可利用Spi表现型。
3.4 利用插入载体和替换载体克隆 • 转染法（环状） • 体外装配（线状）
3.4 利用插入载体和替换载体克隆 • 纯化载体的两个臂。 • 将克隆DNA分子与左臂和右臂混合构建重组分子。 • 连接后产生了左臂—DNA—右臂的多个重复，在体外装配过程中就从cos位点切开，产生重组子。 • 侵染大肠杆菌。
3.5 粘粒 粘粒（cosmid)是噬菌体DNA和细菌质粒的杂合体，含有噬菌体的cos位点。依据：体外装配不仅能装配λ基因组，任何含cos位点的，37-52kb的DNA分子都可装配。
3.6 粘粒克隆 • 粘粒是含有cos位点的质粒，他还需要选择标记，一个复制起始位点。 • 粘粒缺失了λ的所有基因，因此不能形成噬菌斑，而只能形成克隆。 • 常用cosmid: pHC79, pIB8, pKU206
4 大容量λ和其他类型的载体 • 替换载体如λEMBL4可以插入20kb的片段。 • 粘粒可携带40kb。 • 质粒8kb。 • M13小于3kb。
