Transformācija ar Li + jonu metodi

1. Transformācija ar Li+ jonu metodi Aleksejs Fjodorovs Maģistra 1.kurss

2. Transformācija • Pirmo reizi šo terminu pielietoja Griffins 1928 gadā. http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Siegenthaler/Transformation.htm

4. Vēsture • Šī metode tika pirmo reizi publicēta 1983. gadā. • Pirmajā transformācijā tika transformēti S.cerevisiae ar plazmīdas DNS, kas tika iegūta no E.coli (Ito et al, 1983). • Pirmā rauga transformācijas metodes protokols tika balstīts uz E.coli transformācijas protokolu.

5. http://img3.wikia.nocookie.net/__cb20131002205536/mmg-233-2013-genetics-genomics/images/e/e2/Transformation.pnghttp://img3.wikia.nocookie.net/__cb20131002205536/mmg-233-2013-genetics-genomics/images/e/e2/Transformation.png

6. Rauga šūnas transformācijā svarīgās daļas • Šūnas sieniņa • Šūnas membrāna http://www.sigmaaldrich.com Šūnas sieniņas struktūra http://distillique.co.za Šūnas membrānas struktūra

7. Protokols • Iesēj nakts kultūras • Pārlej izaudzēto nakts kultūru sagatavotās 50ml šķidrajās barotnēs un audzē kultūru līdz OD = 2 • Izaudzētās kultūras pārlej 50ml plastmasas mēģenēs ar vāciņu un veic šūnu mazgāšanu ar sterilu destilētu ūdeni. • Resuspendē šūnas  un sajauc ar 400 mikrolitriem sterila destilēta ūdens • Pārlej 50 mikrolitrus jaunā mikromēģenē, cetrifūgē, nosūc supernentantu un pievieno transformācijas maisījumu.

8. Katru transformēto mikromēģeni vorteksē 1 minūti. • Ievieto mikromēģeni sildītājā uz 1 stundu pie 42°C  • Ievieto centrifūgā uz 30 sekundēm pie 5000 apgriezieniem  • Nosūc supernetantu ar mikropipeti un lēnām un uzmanīgi resuspendē šūnas 1 mililitrā sterilā destilētā ūdens un atstāj uz 5 minūtēm.  • Izsēj uz Petrī platēm, kur ir selektīvā barotne (SC ura-) barotne.

9. Barotne • SC barotne: • Amonija sulfāts - 5 g/l • Rauga slāpekļa bāze bez aminoskābēm un amonija sulfāta (Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulphate) - 1,7 g/l • Yeast Syntetic Drop – out Medium Supplement without Histidine, Laucine, Tryptophan and Uracil – 1,4 g/l • Glikoze 20 g/l • Uracils – 20 mg/l • Leicīns – 260 mg/l • Triptofāns – 80 mg/l • Histidīns – 60 mg/l • šķīdina ar destilētu ūdeni

10. Vielu nozīme transformācijas maisījumā PEG ar LiAc iedarbojās uz šūnas sienu ar membrānu un pie paaugstinātas temperatūras 420 tiek vecināta jonu plūsma šūnā, kuras laikā plazmīda iekļūst šūnā.

11. Ierīces http://www.derox.eu/f/products/s/101149_1.jpeg http://biosan.lv/images/uploads/1024x768/ts-100c.png http://biosan.lv/images/uploads/1024x768/uvt-s-ar.png http://www.lu.lv/uploads/pics/centrifuga.jpg http://biosan.lv/images/uploads/1024x768/es-20.png

12. Plusi Mīnusi Šūnas jāaudzē visu nakti (ja nav pieejamas jau sasaldētas šūnas) Celma specifiskās izmaiņas transformācijas efektivitātē • Visefektīvākā (izņemot ar lielām DNS konstrukcijām) • Nav vajadzīgs speciāls aprīkojums • Viegls protokols • Viegli pielāgojams • Var tikt izmantotas sasaldētas šūnas • Mazas izmaksas

13. Izmantota literatūra • Ito H., Fukuda Y., Murata K., and Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. – Journal of Bacteriology, 153(1):163 • Kawai S., Hashimoto W., and Murata K. 2010. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi, 395 – 397 • Gietz D.R. and Woods A.R. 2001. The Genetic Transformation of Yeast, 4: 818 – 824. • http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Siegenthaler/Transformation.htm • http://img3.wikia.nocookie.net/__cb20131002205536/mmg-233-2013-genetics-genomics/images/e/e2/Transformation.png • http://distillique.co.za • http://www.sigmaaldrich.com • http://biosan.lv/images/uploads/1024x768/uvt-s-ar.png • http://www.derox.eu/f/products/s/101149_1.jpeg • http://biosan.lv/images/uploads/1024x768/ts-100c.png

14. Paldies par uzmanību!

15. Jautājums • Kuru katjonu vēl var izmantot transformācijā (aizvietojot) Li katjonu E.coli transformēšanā?