METODI IMMUNOMETRICI

1. quantificazione del complesso antigene-anticorpo complesso antigene-anticorpo campione + anticorpo METODI IMMUNOMETRICI • I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse.

2. LA NASCITA DEI METODI IMMUNOMETRICI 1942. Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluoresceina. 1959. Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977. 1960. Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche. 1969. Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide. 1969. Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA). 1971. Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida. 1972. Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT). 1975. Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

3. VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI • Elevata specificità • Basso limite di rivelazione • Alta produttività analitica • Possibilità di automazione • Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab • Campioni fluidi • (siero, urina, latte) • ANALISI DIRETTA • Campioni solidi • (carne, matrici vegetali, tessuti) • OMOGENEIZZAZIONE • ESTRAZIONE • ANALISI

4. VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI • Elevata specificità • Basso limite di rivelazione • Alta produttività analitica • Possibilità di automazione • Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa • Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”) •  Piccoli volumi di campione •  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi) •  Diagnosi precoce •  Determinazione di sostanze in tracce

5. VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI • Elevata specificità • Basso limite di rivelazione • Alta produttività analitica • Possibilità di automazione • Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti • Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica • Rapidità di esecuzione (poche ore) • Analisi di numerosi campioni per giorno

6. VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI • Elevata specificità • Basso limite di rivelazione • Alta produttività analitica • Possibilità di automazione • Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici • Ottimizzazione delle fasi analitiche • - errori precisione e accuratezza • - tempi di esecuzione rapidità

7. ka Ab An An-Ab + kd ka [An-Ab]eq kd Keq = = [Ab]eq [An]eq INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = 109-1012 M-1

8. COME SI OTTIENE UN ANTICORPO Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. Mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

9. ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II) IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

10. CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI

11. braccio spaziatore aptene carrier anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene ANTIGENI ED APTENI Un apteneè una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier” (es. BSA o KLH) che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene.

12. 100% 40% 100% 100% 100% BaP SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità(capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). La tendenza dell’anticorpo a legare altre molecole, strutturalmente simili all’analita, viene quantificata attraverso la sua reattività crociata. Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici posizione di coniugazione con la proteina carrier utilizzata per la sintesi dell’immunogeno

13. STRATEGIE DI SINTESI DELL’IMMUNOGENO La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dell’immunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse applicazioni immunogeno immunogeno Anticorpo specifico per l’analita Anticorpo specifico per la classe

14. ka Ab An An-Ab + kd ka [An-Ab]eq kd Keq = = [Ab]eq [An]eq INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio:

15. ka [An-Ab]eq Keq = = [Ab]eq [An]eq kd [An-Ab]eq =Keq Abt - Keq [An-Ab]eq [An]eq SCATCHARD PLOT (I) L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard. Riprendendo l’equazione: si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene:

16. [An-Ab]eq =Keq Abt - Keq [An-Ab]eq [An]eq SCATCHARD PLOT (II) Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è– Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e l’intercetta sull’asse x è Abt.

17. SCATCHARD PLOT (III) Keq High affinity Abt Low affinity

18. Retta 1 [An-Ab]/[An] Retta 2 [An-Ab] SCATCHARD PLOT (IV) EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima. • La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo: • eterogeneità (differenza tra le due Keq); • specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

19. An + Ab An-Ab TRACCIANTI La formazione del complesso An-Ab non è in genere facilmente misurabile. Viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto (non viene infatti rivelato direttamente l’analita) introducendo un tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità. Il tracciante viene ottenuto legando un “label” opportuno (specie facilmente rivelabile con una opportuna tecnica analitica) all’antigene, ad un derivato dell’antigene o ad un anticorpo.

20. LABEL Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. • Isotopi radioattivi (125I, 3H) • Molecole fluorescenti • - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) • - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) • - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) • Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) • Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati • - cromogenici • - fluorescenti • - chemiluminescenti

21. SCELTA DEL LABEL

22. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

23. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) • Vantaggi relativi all’uso di enzimi: • sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; • sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; • una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; • è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. • Svantaggi relativi all’uso di enzimi: • l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; • la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; • si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

24. TRACCIANTI ENZIMATICI ENZIMA SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

25. METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA) • Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della • fluorescenza lunghi (10-100 ms) • Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

26. Ru(bpy)32+: ECL label TPA: tripropylamine photon Ru(bpy)32+* products TPA TPA TPA TPA● TPA - H+ Ru(bpy)33+ Ru(bpy)32+ TPA TPA+ TPA Ru(bpy)32+ e- e- electrode CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA Può essere considerata una chemiluminescenza attivata per via elettrochimica anziché chimica.

27. CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA • VANTAGGI: • E’ una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato • Può essere “accesa” e “spenta” (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente) • Non ha segnale di fondo • Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con l’usi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

28. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV) Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche Elettrodi per la produzione del segnale ECL magnete Fasi di reazione e lavaggio: microsfere in sospensione Fasi di eliminazione della soluzione: microsfere trattenute dal magnete

29. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V) Sono a tutt’oggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys:

30. CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI COMPETITIVI ETEROGENEI COMPETITIVI OMOGENEI NON COMPETITIVI OMOGENEI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

31. PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i< [An]i + [An*]i An + Ab An-Ab + An* KAn* An*-Ab

32. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO Antigene Aggiunta del campione Enzima Tracciante Aggiunta del tracciante Substrato enzimatico Incubazione Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

33. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

34. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

35. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

36. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

37. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

38. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

39. segnale segnale concentrazione analita log concentrazione analita PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. log [analita]

40. 1 2 3 Tracciante legato 4 2 1 0 4 16 Conc. analita PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. tracciante analita aggiunta reattivi reazione separazione liberolegato

41. B/B0 log concentrazione analita INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0in funzione dellogaritmo della concentrazione di analita. B0èil segnale ottenuto in assenza di analita B è il segnale a concentrazione x di analita

42. PARAMETRI QUANTITATIVI Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard di B0 Sensibilità pendenza della curva Midrange Concentrazione corrispondente a B/B0 50% B/B0 log concentrazione analita Intervallo dinamico Convenzionalmente compreso fra B/B0 90% e B/B0 10%

43. y a b = fattore di pendenza(*) a/2 c x y a b = fattore di pendenza(*) a+d 2 d c x INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI “FITTING” DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N x = dose y = B (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

44. PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE SI ASSUME ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%) errori

45. B/B0 log concentrazione analita EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI Riduzione del limite di rivelazione: • Ridurre la concentrazione del tracciante • Diminuire la quantità di anticorpo immobilizzato e riottimizzare il metodo (se la rivelabilità del tracciante è adeguatamente elevata, si sposta verso il basso il range dinamico) • Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo e riottimizzare il metodo La rivelabilità assoluta del tracciante ha un effetto solo indiretto, permettendo di lavorare a concentrazioni minori.

46. SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO La specificità di un anticorpo è la sua capacità di discriminare tra antigeni con struttura simile. Tra i vari modi per misurare la specificità di un anticorpo, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. 100 [An-Ab]/[An] 50 0 a b [An]

47. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.

48. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa.

49. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

50. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO