Proteomics Waarom DNA alleen niet genoeg is…

1. Proteomics Waarom DNA alleen niet genoeg is…

2. Van DNA naar organisme Eiwitten zijn de belangrijkste schakels tussen DNA en het organisme. DNA RNA Eiwit Cel Organisme 30.000 genen vertaald genen in eiwit meer dan 1,000,000 eiwitnetwerk 2 miljard jaar evolutie Proteomics voor de massa

3. Een organisme bestaat uit cellen Proteomics voor de massa

4. membraan Porien De kern van iedere cel bevat chromosomen met de genetische code Nucleolus Set met 23 paar menselijke chromosomen met alle genetische informatie Chromatine Chromosomen Proteomics voor de massa

5. Chromosoom ATCCGTTATGCT TAGGCAATACGA DNA Een chromosoom is een opgevouwen streng DNA Proteomics voor de massa

6. Het genoom • DNA is opgebouwd uit 4 bouwstoffen: • de basen of nucleotiden A CTG • Het complete menselijke genoom • bestaat uit 3.000.000.000 nucleotiden • (basen). • Al het menselijk DNA is in kaart • gebracht. De gegevens liggen • opgeslagen in een database … TGAC …… A CTG … Proteomics voor de massa

7. ..AGCTAT CAA ATG CCG TAG ATCCGT AGT GTA AACAAG ATCGTT TGG AAA TTG CAG ATCAGT AAG CGT AGA TCG TGT TGA CG...... Genen en het genotype Alle erfelijke eigenschappen liggen vast in het DNA. Het stukje DNA dat de code bevat voor een erfelijke eigenschap wordt een gen genoemd. Een set van alle genen van een organisme wordt het genotype genoemd. De nucleotiden volgorde van alle genen is bekend. Proteomics voor de massa

8. Fenotype Het fenotype is het totaal van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken) van een organisme. De rups en de vlinder hebben hetzelfde genotype (DNA), maar zijn toch verschillend. Ze hebben een verschillend fenotype. Proteomics voor de massa

9. Van Genotype naar Fenotype • Alle 200 celtypen hebben dezelfde set met genen, maar alleen die eiwitten • worden aangemaakt die de cel nodig heeft voor zijn taak: Expressie. • Verschillen in expressie verklaren de verschillende fenotypen. • Expressie kan beïnvloed • worden door omgevings- • factoren. DNA RNA Eiwit- Eiwit Fenotype Synthese Proteomics voor de massa

10. Eiwitten bepalen hoe we er uit zien • DNA bepaalt wie we zijn • (genetisch bepaald) • Eiwitten bepalen hoe we er uit zien. Proteomics voor de massa

11. Hoe bepalen eiwitten het fenotype ? De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke eiwitten. Maar welke eiwitten en hoeveel van elk wordt bepaald door de expressie van eiwitten. Hoe en wanneer een eiwit actief wordt, wordt Bepaald door de veranderingen die het eiwit nog ondergaat na de expressie: de zogenaamd post-translationele eiwit- veranderingen De eiwitnetwerken bepalen tenslote het functioneel geheel in de cellen, weefsels en het organisme Proteomics voor de massa

12. Leu Thr Ser Val Ala Cys Wat is een eiwit ? • Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren. • Een eiwit kan bestaan uit een keten van 50 tot enkele duizenden aminozuren, • de primaire volgorde of sequentie genoemd. • Een eiwit wordt gevouwen in een complexe 3-dimensionale structuur. • De volgorde van de aminozuren en • ruimtelijke structuur bepalen de functie • van het eiwit. Leu Proteomics voor de massa

13. Hoe wordt een eiwit uit DNA vertaald? Voor elk aminozuur bestaat een unieke combinatie van 3 nucleotiden. De vertaling en aanmaak van eiwitten vindt plaats op de ribosomen van het cytoplasma Verschillende eiwitten met ruimtelijke structuur Antilichaam Hemoglobline Insuline Kinase Synthetase Proteomics voor de massa

14. Wat is Proteomics ? Proteomics is de studienaareiwitten. Proteomics is ook het vergelijken van eiwittentussenverschillendeorganismen, weefsels of cellen Proteomics is ook het vergelijken van eiwitpatronentussengezonde en ziekemensen. ProteinGenomics Proteomics Proteomics voor de massa

15. Analyseren van eiwitten • Het analyseren van eiwitten wordt bemoeilijkt door: • Het grote aantal verschillende eiwitten ( > 1,000,000). • Het hoge moleculaire gewicht van vele eiwitten. • De hoeveelheid materiaal vaak beperkt is. Het kan niet in het lab • vermenigvuldigd worden zoals dat wel met DNA kan (PCR). • dat eiwitten snel kapot gaan. • Dure en geavanceerde analyse apparaten, die nodig zijn. Proteomics voor de massa

16. + - Analyseren van eiwitten • Een veel gebruikte techniek om dat ene bepaalde eiwit te isoleren uit een • mengsel van duizenden eiwitten is 2D-gelelektroforese. • Deze techniek maakt gebruik van de unieke eigenschappen van elk eiwit, • namelijk: het moleculaire gewicht (grootte) en de lading. 1edimensie: lading 2edimensie: grootte pH 10 pH 3 200.000 Dalton pH 10 pH 3 - + pH 10 pH 3 + - 1000 Dalton In een elektrisch veld bewegen eiwitten naar de pH waar ze neutraal zijn. In eenelektrischveldbewegenkleinereeiwittensnellerdangroteeiwitten. Proteomics voor de massa

17. Het resultaat: een eiwitkaart Elk stipje (spotje) op de kaart is een ander eiwit, of een andere variant van een eiwit! pH 3 10 Molecuul gewicht (grootte) 200,000 Dalton 1000 Dalton Proteomics voor de massa

18. Isoleren van een eiwit naar keuze • Het eiwit van interesse wordt uit de gel gesneden en in een reageerbuis • gedaan. • Het eiwit wordt in stukjes “geknipt” met een enzym, bijvoorbeeld trypsine, • omdat het intacte eiwit te groot is om te karakteriseren. • De stukjes (fragmenten) worden gekarakteriseerd in een Massaspectrometer “massaspectrometrie” spot uitsnijden Eiwitten in stukjes knippen met enzym 2D-gel Proteomics voor de massa

19. Wat is Massaspectrometrie (MS) • MS is een krachtige analytische techniek die wordt gebruikt om (onbekende) • eiwitten te identificeren en/of te kwantificeren. • Bovendien kunnen de structuur en chemische eigenschappen van het eiwit • worden achterhaald. • Er zijn verschillende methoden: Electrical field Time-Of-Flight Magnetic field Proteomics voor de massa

20. Wat doet Massaspectrometrie Eenapparaatommoleculente ‘wegen’, eenmoleculaireweegschaal: Voor: • Mengsel van munten met verschillendgewicht • Verschillendaantal per munt Na: • Sorteer op gewicht • Sorteer op aantal massaspectrum Aantal Gewicht (massa) Proteomics voor de massa

21. start finish Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode: “flight tube” Electrisch veld Detector De moleculen gaan “hardlopen” onder invloed van een hoog spanningsverschil in de buis, de snelste (kleinste) komt als eerste aan: Proteomics voor de massa

22. Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode: De snelheidkanwordenomgerekendnaareenmassa. De hoogte van de piekgeeft de hoeveelheidaan. Alle moleculen gaan tegelijkertijd de buis in Kleine moleculen vliegen sneller! Massaspectrum Proteomics voor de massa

23. K Massaspectrometrie van een eiwit: Eiwit: R R K K R K knippen van het eiwit met het enzyme trypsine 1 2 3 4 5 6 Trypsinekniptnaelke lysine (K) of arginine (R), en maaktdaarmeebrokstukken die eindigen op K of R: K R R K R Massaspectrometrie bepaalt de massa’s van de brokstukken Het patroon is uniek voor het eiwit: identificatie van het eiwit! 1 2 3 4 5 6 relative intensity Is te vergelijken met een vingerafdruk van het eiwit! m/z Proteomics voor de massa

24. Identificatie van een eiwit: 1 2 3 4 5 6 Het massaspectrum van een eiwitmengsel wordt vergeleken met de gegevens in de database De 30.000 genen van het menselijk genoom met de bijbehorende eiwitten zijn opgeslagen in een database De computer geeft een lijst met alle mogelijke eiwitten die er in een monster zitten! Proteomics voor de massa

25. Toepassingen van Proteomics: • Kwantificering van de eiwitexpressie met biomarkers onder specifieke • omstandigheden, bijvoorbeeld bij medische behandeling. • Toepassing in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen • Identificatie van eiwitten die een rol spelen bij specifieke ziekten • Identificatie van eiwit biomarkers specifiek voor eiwit expressie Proteomics voor de massa