Dendritic Cell Seminar

1. Dendritic Cell Seminar 树突状细胞课题研讨

2. CONTENTS • Part One Brief Introduction • Part Two Genesis and Distribution • Part Three Life Cycle • Part Four Function • Part Five Application in Clinical Immunology • Part Six In vitro culture

3. Part One Brief Introduction 树突状细胞的简介

4. Pictures of DCs

5. History • The word "dendritic" means “branched like a tree." It comesfrom the Greek "dendron (tree) ". • Dendritic cells were first described by Paul Langerhans (Langerhans cells) in the late nineteenth century. It wasn't until 1973, however, that the term "dendritic cells" was coined by Ralph M. Steinman. In 2007 Steinman was awarded the Albert Lasker Medical Research Award for his discovery.

6. Brief Introduction • Dendritic cells (DCs) are potent antigen presenting cells (APCs) that possess the ability to stimulate naïve T cells. They comprise a system of leukocytes widely distributed in all tissues, especially in those that provide an environmental interface. • DCs are receiving increasing scientific and clinical interest due to their key role in anti-cancer host responses and potential use as biological adjuvants in tumour vaccines, as well as their involvement in the immunobiology of tolerance and autoimmunity.

7. Part Two Genesis and Distribution 树突状细胞的起源与分布

8. 树突状细胞的来源 • 根据来源，可将DC 分为髓系来源的DC（myeloid DC）及淋巴系来源的DC（lymphoid DC）两大类，尽管这两大类DC 均起源于体内的多能造血干细胞，但它们来源于各自的前体细胞且各有不同的功能特点，其差别之一在于髓系DC 前体（与单核、粒细胞有共同的祖细胞）能分化发育成巨噬细胞，而淋巴系DC 前体（与T、NK 细胞有共同前体细胞）能分化为淋巴细胞。大多数DC来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织。

9. 树突状细胞分布与命名 • DC 广泛分布于脑以外的全身各脏器，数量少仅占人外周血单个核细胞的1 %以下,占小鼠脾脏的0.2-0.5 % 。 • 根据分布部位的不同，可将DC 大致分为 • ①淋巴样组织中的DC，主要包括 并指状DC（interdigitating cell, IDC） 边缘区DC 滤泡样DC（follicular DC, FDC） • ②非淋巴样组织中的DC，包括 间质性DC 郎格汉斯细胞（Langerhans cell, LC）等 • ③体液中的DC，包括 隐蔽细胞（veiled cell） 血液DC

10. LC 是位于表皮和胃肠道上皮部位的未成熟DC，高表达FcR、补体受体、MHC I、II 类分子，胞浆内含有称为Birbeck 颗粒的特征性细胞器，可用于LC 的鉴定；LC 具有较强的摄取和加工处理抗原的功能，但其免疫激活能力较弱。 • FDC 不表达MHC II 类分子，而高表达FcR 和C3bR，可将抗原-抗体复合物和抗原-抗体-补体复合物滞留或浓缩于细胞表面，由B 细胞识别，继而激发免疫应答和产生免疫记忆。 • IDC 位于淋巴组织T 细胞区，由LC 移行至淋巴结而来，高表达MHC I 类分子和II 类分子，但缺乏FcR 及补体受体，主要发挥免疫激活作用。

11. 几类主要APC的分布及其主要特性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 细胞名称 体内分布 MHC-II FcR C3R Birbeck颗粒 ───────────────────────────── DC细胞 滤泡DC 淋巴滤泡 ++/- + + - 并指状细胞 同上,淋巴组织 ++++ - - - 胸腺依赖区 胸腺DC 胸腺 ++ + ? + 朗罕细胞 表皮粒层及基层 ++++ + + + 胃肠上皮层 间质性DC 实质性器官间质 ++++ ? ? + 的毛细血管附近 隐蔽细胞 淋巴结输入管 +++ ? ? - 单核/巨噬细胞 全身组织,器官 ++/- + + - B细胞 外周血,淋巴结 ++ + + - CTL的靶细胞 全身有核细胞 MHC-I分子 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

12. Part Three Life Cycle 树突状细胞的生命周期

13. 常用于研究的淋巴系DC 为胸腺内DC，是T 细胞阴性选择的主要承担细胞。但目前对末梢淋巴样DC 的分化发育过程所知甚少。对于髓系DC 的分化发育途径与过程已逐渐清楚。 • 正常情况下绝大多数体内DC 处于非成熟状态（immature），表达低水平的辅助刺激分子和粘附分子，体外激发MLR 能力较弱，但具有极强的抗原内吞和加工处理能力。 • 在摄取抗原或受到某些刺激（主要是炎性信号如LPS、IL－1β、TNF－α）后，可以分化成熟（mature），其MHC 分子、辅助刺激分子、粘附分子的表达显著提高，体外激发MLR 能力很强，但其抗原摄取加工能力显著降低。 • DC 在成熟过程中同时发生迁移（migration），由外周组织（获取抗原信号）通过淋巴管和/或血循环进入次级淋巴器官，然后激发T 细胞应答。 • 髓系DC 的分化发育分为四个阶段：前体阶段、未成熟期、迁移期、成熟期，各阶段DC 有不同的功能特点。

14. 1、 前体阶段DC • 目前从人胎儿肝脏、脐血、骨髓、成人外周血以及小鼠的骨髓和外周血中均分离出髓系前体，其功能在于产生各种髓系DC。在体内，这些前体的作用可能是维持非淋巴组织内DC 的数量达到一定水平。 • 外周血单核细胞（PBMC）被认为是Mφ和DC 的共同前体，在体外能在某些细胞因子存在的条件下直接发育为DC，在体内它们有可能趋化至炎症反应部位，并受到炎症刺激因素及某些细胞因子的影响，而发育为DC 或Mφ。 • 在急性炎症状态下，DC 前体均能迅速动员至非淋巴组织。

15. 2、 未成熟期DC • 髓系DC 在从前体发育为具有强免疫刺激功能的成熟DC 的过程中，需经过一个未成熟阶段，此阶段DC 的功能对于免疫应答来说十分重要。 • 未成熟DC 主要存在于多种实体器官及非淋巴组织的上皮（此处的DC 即为LC），能表达一些膜受体如FCγRⅡ、甘露糖受体（人DC）或DEC205 分子（鼠DC），这些受体能介导DC 摄取抗原；未成熟DC 也能通过吞饮和吞噬作用摄取抗原。未成熟DC 内含有一些重要的细胞器包括内体、MⅡC和溶酶体等，能合成MHC Ⅱ类分子。此外，未成熟DC 还能分泌一些趋化性细胞因子和具有炎症介质作用的细胞因子，如LC 能产生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-15等。因此，未成熟DC 具有摄取和加工处理抗原的功能，但其刺激初始T 细胞的能力很弱。受炎症刺激因素的影响，它们能从非淋巴组织进入次级淋巴组织并逐渐成熟。

16. 3、 迁移期DC • DC 在摄取抗原后MHC 分子及粘附分子的表达上调，迁移能力增强，由外周逐渐向次级淋巴器官归巢，与此同时，其摄取、处理完整蛋白抗原的能力下调，在次级淋巴器官内，DC 完成其免疫激发功能。 • 这类DC 主要存在于输入淋巴管、外周血、肝脏血液及淋巴组织，经过淋巴和血液循环，从输入淋巴管进入淋巴结。从外周血进入脾脏或从肝窦进入腹腔淋巴结，从而启动T 细胞产生免疫应答。

17. 4、 成熟期DC • 成熟期DC 主要存在于淋巴结、脾脏及派氏结合淋巴结。它们受趋化性细胞因子的作用归巢至T 细胞区，同时本身也分泌一些趋化性细胞因子，从而保持与T 细胞的接触。 • 成熟DC 的细胞表型特征是除表达特异性抗原外，还高表达MHC I 类分子、MHC II 类分子、CD80、CD86、CD40、CD54 即细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM－1)和热休克蛋白（heat shock protein,HSP）等免疫刺激分子。 • 由于成熟DC表达高水平抗原肽－MHC 分子复合物及高水平辅助刺激分子CD80、CD86 及CD40 等，并能分泌IL-12，尤其是在CD40 配体的作用下能分泌Th1 型细胞因子，因而它们能有效地将抗原提呈给初始T 细胞，并使之激活，活化T 细胞后它们自身即出现凋亡。

19. Part Four Function 树突状细胞的功能

20. 未成熟与成熟DC功能比较 • 组织中未成熟DC - 强吞噬和吞饮作用 - 处理抗原能力强 - 低水平的MHC - 缺乏共刺激分子 - 递呈抗原能力弱 • 淋巴组织中成熟DC - 不再有吞噬能力 - 表达共刺激分子 (B7-1, B7-2) - 高表达MHC和黏附分子 - 抗原递呈能力强

21. DC功能综述 1.摄取、加工处理和提呈抗原，启动特异性免疫应答，是专职抗原提呈细胞。摄取抗原的方式如下： （1）吞饮作用(pinocytosis )：细胞吞入液态物质或极微小颗粒的过程称为吞饮或胞饮。 （2）受体介导的内吞作用(receptor-mediated endocytosis)：大分子物质首先被细胞膜表面特异性受体识别并与之结合，经过内化并通过膜囊泡系统完成物质的转运。 （3）吞噬作用(phagocytosis)：吞噬作用乃指细胞非特异性吞入较大颗粒或分子复合物（如细菌、细胞碎片等）的过程。

22. DC功能综述 2.DC是体内重要的免疫调节细 胞，可通过分泌不同的细胞 因子参与天然和适应性免疫 应答。 （1） 分泌IL-12诱导T细胞分化为Th1细胞，增强细胞免疫应答 （2） 分泌Ⅰ型IFN，发挥抗感染及免疫调节作用 （3） 分泌IL-10，TGF-β，诱导B细胞发生Ig类别转换，产生IgA类抗体。 （4） 分泌IL-1β，促进T、B细胞活化。

23. DC的抗原提呈途径 CD1分子呈递途径 胞质溶胶途径 溶酶体途径

24. 利用TAP的能量抗原肽进入高尔基体腔形成分泌小泡利用TAP的能量抗原肽进入高尔基体腔形成分泌小泡 小泡转移至细胞膜表面,抗原肽被提呈 抗原肽被位于内质网表面的TAP捕获并与MHC-I分子结合 病毒蛋白在胞质内被蛋白酶体降解为抗原肽

25. 复合物经过高尔基体进入溶酶体小泡,被降解为抗原肽复合物经过高尔基体进入溶酶体小泡,被降解为抗原肽 小泡转移至细胞表面,抗原肽被提呈 同时恒定链被降解，抗原肽与MHC-II结合 MHC-II类分子以两条链固定于内质网,同时有一条恒定链加固

26. CD1分五型：CD1A、B、C、D、E, 与b2m组成二聚体；与MHCI/II类分子有30%同源性，无多态性；表达于专职APC表面，还可存在于内体/溶酶体腔室中，酸性环境改变其构象，与抗原结合。主要递呈糖脂或脂类抗原，特别是分支杆菌的某些成分； 递呈给CD4+T、CD8+T、CD4-CD8-T、NKT细胞。

27. Toll样受体与DC的两条信号传递途径 • 模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）：存在于固有免疫细胞表面的一类能直接识别结合病原微生物或宿主凋亡细胞表面某些保守分子结构的受体。TLRs就是一类重要的PRR。 • MyD88分子:是髓样细胞分化时表达的蛋白，羧基末端含有TIR结构域，是发挥功能的核心部分，同时，在氨基末端含有死亡结构域，（death domain,DD）可以和其他分子形成结合物，而传递信息。 • MyD88依赖途径是多数TLR家族成员的信号传导途径，同时也是不成熟DC发挥吞噬功能释放炎性细胞因子的信号途径。MyD88非依赖途径上调DC表面共刺激分子的表达和增强DC的抗原提呈功能方面发挥重要的作用。

28. Toll样受体与DC的两条信号传递途径 • DC表面的Toll受体在接受外界刺激信号和诱导机体产生免疫应答方面具有核心作用。 • TLRs介导的胞内信号穿导通路主要有两条：髓样分化蛋白88(MyD88)依赖途径与MyD88非依赖途径。这两条传导通路中的大部分接头蛋白分子是一致的，但在某些关键点上又有所不同，因此决定了它们的功能彼此交叉。

29. Part Five Application in Clinical Immunology 临床免疫应用

30. 功能机制 • 表面抗原:包括MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子，共刺激分子及粘附分子。 DC的抗原递呈功能与它们的表达密切相关。 • MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子能与抗原肽结合，把抗原和免疫复合物分别递呈给CD8 + 、CD4 + T淋巴细胞; • CD54/ICAM-Ⅰ是淋巴细胞功能相关抗原l（LFA-1）的配体，参与抗原递呈; • CD58（LFA-3）与T淋巴细胞表面CD2受体相结合，参与辅佐信号的产生和传递; • 白细胞共同抗原异构体（CD45RO）参与调节信号传导; • CD44参与T淋巴细胞的活化; • CD40-CD40L参与B淋巴细胞的活化、增殖的调节，提供上调DC表达B7的激活信号，同时也为辅助T淋巴细胞（Th细胞）产生IL-4、IL-5、干扰素（IFN-γ）提供信号，并协调IL-12诱导T淋巴细胞产生IFN-γ 。 • 表面受体:DC表面的FcR和CRl主要参与抗原性异物和免疫复合物的捕获。 • DC表面存在I型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）受体—— DC-SIGN，其氨基酸序列与C型植物血凝素相同，能够与T淋巴细胞表面的ICAM-3结合，介导DC与幼稚T淋巴细胞之间的结合，促进HIV-l进入CD4 + T淋巴细胞。 • 人LC表面的神经肽受体，可与神经系统产生的神经肽相结合，从而使DC的功能受神经系统的调节。 • CDwl50（1PO-3）为共刺激受体，参与信号转导。

31. 免疫激活和免疫耐受 • 如前所述，DC 对于T、B 细胞具有直接或间接的激活作用。 • DC 表达多种趋化性细胞因子，具有趋化T 细胞的作用。DC 可直接激活T 细胞，提呈于DC 膜表面丰富的抗原肽－MHC I 类分子复合物、抗原肽－MHC II 类分子复合物，为相应的CD8＋、CD4＋T 细胞的结合提供了分子基础。 • DC 除了为T 细胞提供抗原肽－MHC 分子复合物这一抗原信号（第一信号）外，还高表达CD80、CD86、CD40 等辅助刺激分子，为T 细胞提供了充分的第二信号。DC 高表达ICAM－1 等粘附分子，更有助于与T 细胞的进一步结合。 • 此外，DC 所分泌的IL－12 对于初始T 细胞是产生Th1 型免疫应答的重要因素。DC 还能通过诱导Ig的类别转换、通过释放某些可溶性因子等调节B 细胞的增殖与分化。 • DC 还能诱导免疫耐受。目前发现DC 是在胸腺内对发育中T 细胞进行阴性选择的最重要的细胞，通过排除自身反应性T 细胞克隆，参与中枢免疫耐受的诱导。血循环中的抗原，在浓度很高的情况下，可以到达胸腺，由胸腺DC 提呈。DC 亦可在外周参与外周致耐受作用。

32. 临床免疫应用 • DC在机体的免疫系统中扮演了一个重要角色，是最有效的专职抗原提呈细胞，在抗血液系统肿瘤的治疗中具有突出的优势。 • 在GM-CSF及IL-4的共同作用下，DC迅速发展为成熟的DC，可表达丰富的MHC-I及MHC-II类分子，提呈丰富的肿瘤抗原肽，使相应T细胞的TCR被充分占据，同时DC提供了高水平的B7-1、B7-2、CD40分子，有利于DC与其它免疫细胞间的信息传递。DCT IL-12 Th1型的应答，利于肿瘤病灶的清除DC可以分泌趋化因子，专一性趋化初始T细胞，促进T细胞聚集，增强对T细胞的激发。

33. 临床免疫应用 • 应用DC 的免疫激活作用和诱导免疫耐受的特点，可将DC 用于某些疾病的治疗，如用病原体抗原在体外致敏DC，通过过继回输的方式激活免疫应答，以治疗多种感染性疾病、应用肿瘤抗原致敏的DC 回输机体以治疗肿瘤等；在移植免疫中，供体的非成熟DC 倾向于诱导免疫耐受，而成熟DC 倾向于引发免疫排斥。因此，若预先去除移植物中DC 或用非成熟DC 诱导同种免疫耐受，均可延长同种移植物的存活时间；DC 在自身免疫性疾病和变态反应性疾病发生发展中起一定的促进作用，阻断或降低DC 的APC 功能，或用非成熟DC 诱导特异性外周免疫耐受，可以达到防治此类疾病的目的。

34. DC肿瘤疫苗 • 肿瘤常规治疗主要是外科手术、放疗、化疗等方法，其失败的主要原因是因为其疗效的非特异性，无法根除远处转移的微小病灶，而肿瘤免疫疗法的主要目的是要发展肿瘤疫苗，诱导机体的免疫系统来识别和清除其微小转移灶。这种肿瘤疫苗被称为治疗性疫苗。肿瘤抗原的免疫原性往往很弱，为了增强机体的免疫应答，将自身的DC进行培养并将肿瘤抗原导入DC，可以激发对肿瘤细胞的免疫反应，此即为以DC为基础的肿瘤疫苗。 • DC肿瘤细胞性抗原疫苗 • DC肿瘤多肽抗原疫苗 • DC肿瘤抗原mRNA疫苗 • DC基因修饰疫苗 • DC亚细胞结构肿瘤疫苗 • DC疫苗注射途径对诱导全身性免疫应答意义重大 。Fong等认为，皮内和淋巴管内注射DC诱导Th1细胞介导的免疫应答频率比静脉注射高，后者诱导特异性抗体频率和滴度明显比前二者高。 • 免疫反应监测 用于检测特异性免疫应答的方法有细胞毒性试验、流式细胞仪检测效应性细胞因子释放、酶联免疫斑点法、四聚体技术等。

35. Part Six In vitro culture 树突状细胞的体外培养

36. 使血液中单核细胞分化成树突状细胞 • 基本原理 应用GM-CSF 和IL-4 使血液中单核细胞分化成树突状细胞，并用IFN-α促进树突状细胞的成熟。 • 试剂和材料 新鲜的外周（肝素）抗凝血液 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)。hrIL-4 hr IFN-α。 培养液： （1） RPMI1640 全培基：RPMI1640 10% 胎牛血清（ FCS、热灭活） 2mmol/LL-谷氨酰胺 100IU/ml 青霉素 100μg/ml 链霉素 1g/L 非必需氨基酸 1 mmol/L 丙酮酸钠 5×105 mol/L 2 巯基乙醇。 （2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基 IL-4(40ng/ml) GM-CSF(50ng/ml) （3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基 IFN-α（1 ~ 10ng/ml）。 • 器皿及仪器 培养瓶（25ml 75 ml）CO2孵箱、光学显微镜、血细胞计数器、垂直气流超净台、离心机等。

37. 使血液中单核细胞分化成树突状细胞 • 实验操作 1、制备单核细胞 2、将单核细胞培养基在含GM-CSF 和IL-4 的RPMI1640 培基液中，细胞浓度为1×106 /ml，置5%CO2孵箱中， 37℃孵育3天。 3、培基第3 天换液，轻轻吸去原培养液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鲜1640 培氧液，继续置CO2 培养。 4、促树突状细胞成熟：单核细胞经与IL-4 和GM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成树突状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培养液，更换等量的含有IFN-α的RPMI1640 培养液，继续置5%CO2 孵箱中，37℃培养，至第9 天时可获得成熟的树突状细胞。

38. DC的鉴定及记数标志 • 由于尚没有鉴定出DC 的特异性分子标志，目前只能通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应（MLR）中能刺激初始T 细胞增殖等三个方面加以综合判断。 • 当然，也有数种DC 相对特异性标志得到人们的公认和应用，例如33D1 和NLDC145 是小鼠DC 比较特异性的标志；人DC 的主要特征性标志为CD1a、CD11c 和CD83。 • CDla主要表达于胸腺细胞和DC，是鉴定人外周血与骨髓中DC的最好标记，也是对DC进行计数的标志。Rouard等发现CD83是DC成熟的标志，其激活T淋巴细胞功能最强。Birbeck首先在人上皮组织中发现Birbeck颗粒，它是LC最可靠的形态学鉴别依据，为LC特征性颗粒。Fascin是人外周血中另一DCs的标志。 • DC 能表达可特异性结合病原微生物的受体以及FcR，这些分子主要参与抗原的摄取；DC 还表达MHC II 类分子、辅助刺激分子CD80 及CD86、粘附分子CD40、CD54 以及β1、β2 整合素家族成员，参与抗原的提呈。此外，DC 还能分泌IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α、IFN－α/β等细胞因子及多种趋化性细胞因子，参与机体的免疫调节。

39. Thank you ! 制作群组 周晨光 周凌云 刘凯丽 宋灏