Úvod do biochémie

1. Úvod do biochémie Dagmar HEINOVÁ

2. Začlenenie živých systémov v rámci hmotných sústav Živé systémy (bunka, organizmus ako celok) sú špecifickou formou štruktúrne-funkčného usporiadania hmoty. Sú súčasťou hmotných sústav, ktoré existujú okolo nás i v nás. Súčasná veda pozná nasledujúce typy hmotných sústav:

3. Hmotné sústavy • elementárne častice a polia; atómy a molekuly; mikroskopické a makroskopické telesá; Zem a iné planéty; hviezdy; vnútrogalaktické systémy; Galaxia; sústava galaxií; metagalaxie; živé sústavy.

4. Spoločné vlastnosti hmotných sústav Všetky typy hmotných sústav včítane živých systémov sa vyznačujú niektorými základnými a univerzálnymi vlastnosťami, ktoré ich navzájom spájajú: - jestvujú v priestore a v čase, v ktorom na seba navzájom pôsobia; - majú svoju štruktúru a systémovú organizovanosť; - sú v neustálom pohybe a majú schopnosť neustálej premeny z jedného stavu na iný.

5. Ciele a zameranie biochémie

6. Pred 4 miliardami rokov vznikol na Zemi život, a to v podobe jednoduchýchmikroorganizmov. Tieto si vyvinuli schopnosť využívať energiu z organických zlúčenín alebo zo slnečných lúčov na tvorbu (syntézu) širokej škály zložitých biomolekúl za využitia jednoduchých prvkov a zlúčenín. Biochémia študuje ako vznikajú jedinečné vlastnosti živých organizmov z týchto neživých biomolekúl. Jej cieľom je ukázať ako neživé molekuly, ktoré tvoria

7. organizmus navzájom interagujú za účelom udržania a zachovania života, pričom sa riadia fyzikálnymi a chemickými zákonmi, ktoré riadia neživý svet. Hlavné charakteristiky živých sústav, ktoré ich odlišujú od neživých: - vysoký stupeň chemickej komplexnosti a mikroskopická organizovanosť; - prítomnosť systémov schopných využiť a transformovať energiu zo svojho

8. prostredia; - majú schopnosť presnej vlastnej replikácie a seba organizovania sa; - obsahujú mechanizmy pre vnímanie a odpovedanie na zmeny v ich prostredí; -každá zlúčenina má svoju presnú funkciu, pričom medzi nimi existujú vzájomné regulačné mechanizmy.

9. Základy biochémie - molekulová biológia; - chémia; - fyzika; - genetika; - evolučné štúdie.

10. I. Molekulové základy biochémie Napriek veľkej rôznorodosti živých organizmov (tvar, veľkosť, špecializácia funkcií) zdieľajú tieto systémy niektoré spoločné základné vlastnosti: - základnou štruktúrne-funkčnou jednotkou je bunka; - prítomnosť plazmatickej membrány, ktorá oddeľuje bunkový obsah od okolitého prostredia a má charakteristické zloženie: lipidovú dvojvrstvu s obsahom bielkovín s rôznou funkciou (receptory, transportné kanály, enzýmové systémy, atď.);

11. - obsah bunky tvorí cytoplazma, ktorá je zložená z cytosolu s obsahom: rôzne - rôznych suspendované častice (organely) so špecifickými funkciami (kompartmentácia: jadro, mitochondrie, Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum, peroxizómy, ribozómy, lyzozómy, atď); - enzýmy a RNA molekuly oba vo vysokých koncentráciách; - zložky tvoriace biomakromolekuly (aminokyseliny, nukleotidy);

12. - stovky malých organických molekúl – metabolitov; - intermediáty biosyntetických a degradačných ciest; - koenzýmy; - anorganické ióny. Rozdelenie organizmov podľa spôsobuzískavania energie potrebnej pre ich život : 1) fototropné (gr. trophos – výživa, potrava);

13. pre svoju existenciu zachytávajú a využívajú energiu slnečných lúčov (fotosyntéza); 2) chemotropné organizmy získavajú energiu z energeticky bohatých chemických zlúčenín prijatých potravou, ktoré oxidujú na vodu a oxid uhličitý (oxidatívna fosforylácia spojená s glykolýzou, pyruvátdehydrogenázovým systémom a Krebsovým cyklom).

14. II. Chemické základy biochémie - iba 30 chemických prvkov je nevyhnutných pre existenciu živých organizmov, z ktorých len 4 sú základné pre tvorbu biomolekúl: vodík, kyslík, dusík a uhlík – tvoria až 99% atómov prítomných v bunke. Jedná sa o najľahšie prvky schopné tvoriť jednu, dve, tri až štyri väzby, pričom tieto prvky tvoriasilné väzby. - biomolekuly sú zlúčeniny uhlíka s obsahom veľkej škály funkčných skupín.

15. - systém usporiadania uhlíkových atómov: Kovalentne viazané uhlíkové atómy v biomolekulách môžu tvoriť lineárne reťazce ako aj cyklické štruktúry. Na tieto uhlíkové skelety sú naviazané funkčné skupiny, čím molekula získava svoje špecifické chemické vlastnosti. Typické biomolekuly sú napr.: - alkoholy s hydroxylovou/ými funkčnými skupinami; - amíny s amino skupinami;

16. - aldehydy a ketóny s karbonylovými skupinami; - karboxylové kyseliny s karboxylovými skupinami. - mnoho biomolekúl obsahuje dve a viac rôznych druhov funkčných skupín, z ktorých každá má svoje chemické vlastnosti a poskytuje vlastné chemické reakcie. Tým je zabezpečená štruktúrne-funkčná biochemická špecificita príslušných látok.

17. - bunky obsahujú univerzálnu sadu malých molekúl prítomných v ich vodnej fáze (cytosole): aminokyseliny, nukleotidy, sacharidy a ich fosforylované deriváty, karboxylové kyseliny; - plazmatická membrána je pre uvedené molekuly nepriepustná a ich pohyb do a von z bunky zabezpečujú špecifické membránové transportéry; -univerzalita výskytu týchto malých molekúl v rôznych bunkách pravdepodobne odráža

18. evolúciu metabolických ciest, ktoré sa vyvinuli vo vývojovo raných bunkách.

19. Hlavnými zložkami živých sústav (buniek) sú biomakromolekuly. Sú to polyméry s veľkou molekulovou hmotnosťou zložené zo základných monomérov: - proteíny z aminokyselinových jednotiek; - nukleové kyseliny z nukleotidov a - polysacharidy z monosacharidov. Syntéza makromolekúl je spojená s hlavnou spotrebou energie v bunke. Makromolekuly sa môžu ďalej organizovať do supramolekulových komplexov, ktoré

20. tvoria funkčné jednotky (napr. ribozómy, oxidačno-redukčné enzýmy dýchacieho reťazca, atď.).

21. Enzymológia Dagmar HEINOVÁ

22. Vlastnosti živých sústav Základnou vlastnosťou hmoty je pohyb. Rozumieme tým predovšetkým schopnosť hmoty premieňať sa z jedného stavu na iný. Všetky životné procesy ako prejavy pohybu hmoty sú spojené s premenami (biotransformáciami) látok a energie, ktorý nazývame metabolizmus (obr. 1):

23. TOK LÁTOK A ENERGIE V ŽIVÝCH SÚSTAVÁCH teplo živá sústava (metabolizmus) živiny, O2 exkréty energia H2O CO2 + H2O anabolizmus katabolizmus

24. Základná charakteristika enzýmov Chemické reakcie (biotransformácie) prebiehajú v živých sústavách v prítomnosti látok, ktoré nazývame enzýmy. Z funkčného hľadiska sa jedná o biokatalyzátory, t.j. urýchľujú chemické deje, ktoré by bez ich prítomnosti vôbec nemohli prebiehať,

25. prípadne by prebiehali extrémne dlho alebo by vyžadovali extrémnu teplotu, tlak či pH. Enzýmom katalyzované reakcie prebiehajú 103až 1017 krát rýchlejšie než tie isté nekatalyzované reakcie. Túto vlastnosť enzýmov nazývame katalytická mohutnosť enzýmov. Vyjadruje sa podielom rýchlosti katalyzovanej reakcie kcat ku nekatalyzovanej reakcie knekat (Tab. 1):

26. Katalytická mohutnosť enzýmov Enzým v bez E v katalyzovaná E (s-1) (s-1) Chymotrypsín 4.10-9 4.10-2 Lyzozým 3.10-9 5.10-1 Triozofofosfát- Izomeráza 6.10-7 2.103 Fumaráza 2.10-8 2.103 Ureáza 3.10-10 3.104 Adenozín- deamináza 1.10-12 1.102 Alkalická fosfatáza 1.10-15 1.102

27. Katalytická mohutnosť niektorých enzýmov Enzým akceleračná rýchlosť (kcat/knekat) Chymotrypsín 1.107 Lyzozým 2.108 Triozofosfátizomeráza 3.109 Fumaráza 1.1011 Ureáza 1.1014 Adenozíndeamináza 1.1014 Alkalická fosfatáza 1.1017

28. Špecificita enzýmov Okrem katalytickej mohutnosti sa enzýmy vyznačujú vlastnosťou, ktorú nazývame špecificita. Špecificita enzýmu je spojená s látkou, ktorej biochemickú premenu enzým katalyzuje. Ako výsledok tejto reakcie vzniká nová chemická látka. V biochémii používame na označenie chemicky premieňanej látky pojem substrát, vzniknutú látku nazývame produkt.

29. Niektorý enzým môže zabezpečovať katalýzu premeny viacerých štruktúrne podobných substrátov (široká špecificita, napr. proteázy, hexokinázy), zatiaľ čo iný enzým je schopný pôsobiť iba na jedinú chemickú molekulovú štruktúru (striktná špecificita: prevažná časť enzýmov). Špecificitu enzýmu podmienenú štruktúrou substrátu nazývame substrátová špecificta.

30. Okrem substrátovej špecificity sa enzýmy vyznačujú aj tzv. reakčnou špecificitou (špecificita enzýmovej reakcie). Špecificita enzýmovej reakcie vyjadruje skutočnosť, že pri premene substrátu na produkt nedochádza k tvorbe vedľajších nežiaducich, toxických, resp. potenciálne toxických produktov (usporiadanie premeny látok do step-by-step nasledujúcich reakcií v rámci metabolických ciest).

31. ZÁVER Vysoká katalytická účinnosť a špecificita enzýmov zabezpečuje pre živé bunky: a) úsporu energie b) zabraňuje tvorbe potenciálne toxických vedľajších produktov jeho metabolizmu.

32. Štruktúra enzýmov Väčšina enzýmov má charakter bielkoviny. Existujú aj niektoré tRNA, ktoré sa vyznačujú katalytickou aktivitou. Bielkovinové enzýmy, ako všetky bielkoviny, majú svoju primárnu štruktúru, ktorá determinuje ich sekundárnu a terciárnu štruktúru. Obr.: primárna štruktúra chymotrypsínu:

33. Primárna štruktúra chymotrypsínu

34. Z hľadiska terciárnej štruktúry má väčšina enzýmov globulárny charakter vďaka čomu sa vyznačujú hlavnou funkčnou vlastnosťou globulárnych bielkovín: schopnosťou špecificky viazať jednu alebo viac molekúl iných látok (substrátov, inhibítorov, koenzýmov, atď.): Obr.: Schéma terciárnej štruktúry chymotrypsínu:

35. Chymotrypsín Chymotrypsín Aktívne miesto: His57-Asp102- -Ser195

36. schopnosťou špecificky viazať jednu alebo viac molekúl iných látok (substrátov, inhibítorov, koenzýmov, atď). Na povrchu enzýmu sa nachádza tzv. aktívne miesto (centrum) enzýmu. Je to spravidla hydrofóbna štrbina na povrchu enzýmovej molekuly, ktorá obsahuje aminokyselinové zvyšky nazývané katalytické skupiny. Katalytické skupiny priamo zabezpečujú tvorbu alebo rušenie chemických väzieb premieňaného substrátu. Takýmito funkčnými skupinami sú najčastejšie:

37. Voľné karboxylové skupiny kyseliny glutámovej a asparágovej; Amidové skupiny glutamínu a asparagínu; Guanidínová skupina arginínu; 6-aminoskupina lyzínu; hydroxylová skupina serínu; fenolová skupina tyrozínu; tiolová skupina cysteínu; imidazolové jadro histidínu; indolové jadro tryptofánu.

38. Okrem terciárnej štruktúry majú niektoré enzýmy aj tzv. kvartérnu štruktúru. Táto štruktúra sa vyznačuje tým, že enzýmová molekula pozostáva z viacerých navzájom spojených polypeptidových podjednotiek, pričom katalytická aktivita enzýmu spravidla sa prejavuje iba v tomto usporiadaní (dimérna štruktúra katalázy, kvartérna štruktúra laktátdehydrogenázy, atď.)

39. Ľudská dihydrofolátreduktáza v komplexe s kyselinou listovou Dihydrofolátreduktáza je enzým, ktorý redukuje kyselinu dihydrolistovú na kyselinu tetrahydrolistovú za použitia NADPH ako donora elektrónov (de novo syntéza purínov a niektorých aminokyselín).

40. Okrem aktívneho miesta na molekule enzýmu často rozoznávame tzv. väzbové miesto enzýmu. Je to sekvencia aminokyselín blízko aktívneho miesta, kde sa viaže substrát, avšak tu nedochádza k jeho premene na produkt. Zabezpečuje správnu orientáciu substrátu za účelom jeho väzby na aktívne centrum. Ďalšie funkčné skupiny bielkovinovej molekuly enzýmu sú dôležité pre pôsobenie enzýmu tým, že udržujú priestorovú štruktúru enzýmu, a tým aj aktívneho miesta enzýmu.

41. Predĺžené väzbové miesto trypsínu

42. Väzba substrátu na aktívne miesto enzýmu - staršia teória väzby substrátu na aktívne miesto enzýmu ju vysvetľovala analógiou princípu zámku a kľúča. Podľa tejto teórie by aktívne miesto bolo plasticky vytvárané ako presný odliatok (negatív) príslušného substrátu. (E. Fischer). - novšia teória predpokladá, že aktívne miesto enzýmu je menej presným negatívom substrátu, je však ohybné

43. (flexibilné) takže pri vzájomnej väzbe so substrátom sa jeho tvaru prispôsobí. Táto teória sa nazýva teória indukovaného prispôsobenia (Koshland, 1958).

44. Charakterizácia enzýmov podľa štruktúry molekluly V prípade väčšiny enzýmov je celá molekula včítane aktívneho miesta bielkovinovej povahy. Takéto enzýmy nazývame apoenzýmy (predovšetkým hydrolázy). Iné enzýmy majú vo svojej molekule pevne viazaný atóm kovu, a preto ich nazývame metaloenzýmy, napr.

45. Zn v karboxypeptidáze. Na katalytickom pôsobení mnohých enzýmov sa zúčastňujú tzv. kofaktory. Je to nebielkovinová zložka, ktorá obvykle preberá od substrátu niektoré atómy alebo skupiny atómov a v nasledujúcej reakcii ich odovzdáva inému substrátu alebo kofaktoru. Ak je kofaktor pevne viazaný na bielkovinovú zložku enzýmu nazývame ho prostetická skupina, napr.

46. flavínmononukleotid (FMN) a flavínadeníndinukleotid (FAD) u oxidoreduktáz, pyridoxalfosfát u aminotransferáz). Ak sú kofaktory viazané na bielkovinovú časť enzýmu len slabo, môžu od nej disociovať. Takéto kofaktory nazývame koenzýmy. Bielkovinová zložka (apoenzým) má v tomto prípade dve väzbové miesta: na jedno sa viaže koenzým a na druhé miesto sa viaže substrát (komplex sa

47. nazýva holoenzým) (napr. dehydrogenázy a koenzým nikotínamidadeníndinukleotid (NAD)). Enzýmy, ktoré katalyzujú v bunke za sebou nasledujúce metabolické reakcie sú často usporiadane do tzv. multienzýmových komplexov. Jednotlivé zložky v týchto komplexoch sú usporiadané tak , aby priebeh reakcií bol optimálny (pyruvátdehydrogenáza).

48. SÚHRN apoenzým – iba bielkovinová molekula holoenzým – bielkovinová časť molekuly spolu s nebielkovinovou zložkou (koenzým, resp. prostetická skupina

50. Princíp pôsobenia enzýmov Princíp pôsobenia enzýmov spočíva v znižovaní voľnej energie reakcie, ktorú enzým katalyzuje (viď nasledujúci obrázok). Bez prítomnosti enzýmu má reakcia „vysokú“ energetickú bariéru pre uskutočnenie reakcie, zatiaľ čo v prítomnosti enzýmu sa táto aktivačná energia znižuje a reakcia sa tým urýchľuje: