Paredes celulares procariotas (3)

1. Paredes celulares procariotas (3) Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos. Formas L

2. Cómo sintetizar un sáculo cerrado fuera del protoplasto • El PG es una estructura “cerrada” • Pero debe de “crecer”  • Debe de “abrirse” de algún modo controlado para incorporar nuevo material • Debe facilitar el proceso de división en dos células hijas, a partir de un septo • ¿Cómo transportar una macromolécula tan grande al exterior? • ¿Cómo se resuelve el aporte de energía para la biosíntesis en el exterior del protoplasto?

3. Biosíntesis del PG: visión de conjunto • Síntesis de precursores solubles en el citoplasma • Los precursores son recogidos por un transportador de membrana y se forman las uu. disacarídicas con el pentapéptido • Las uu. disacarídicas-(pentapéptido), expuestas al exterior, son polimerizadas  cadenas lineales de PG • La cadena lineal de PG recién formado se une al PG preexistente por transpeptidación

4. Fase 1 (en el citoplasma) • Activación de los monosacáridos: • UDP-NAG • UDP-NAG + PEP  UDP-NAM • Unión secuencial aa. al NAM (con ATP y Mn): • NAM-L-ala • NAM-L-ala-D-glu • NAM-L-ala-D-glu –di aa (m-DAP, L-Lys) • NAM-L-ala-D-glu –di aa-D-ala-D-ala • Al final de esta fase tenemos en citoplasma: • UDP-NAG • UDP-NAM-(pentapéptido)

6. Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (a) • El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P  bactoprenol-P-P-NAM-(pentapéptido)

7. Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (b) • El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P  bactoprenol-P-P-NAM-(pentapéptido) • Ahora se transfiere la NAG desde el UDP para unirse por transglucosidación con el NAM. • Tenemos, pues: bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG • Bactoprenol está en membrana citoplásmica. NAM(pentapéptido)-NAG está en principio colgando hacia el citoplasma, pero ahora...

9. Fase 3: transglucosidación y producción de PG lineal • ... El bactoprenol cargado con la unidad NAM(pentapéptido)-NAG se va al otro lado de la membrana (flip-flop), con lo que la unidad queda expuesta hacia el exterior • Transglucosidación: dos unidades de bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG reaccionan • Queda libre un bactoprenol-P-P ( bactoprenol-P, por fosfatasa específica) • Queda un bactoprenol-P-P unido a dos unidades de NAM(pentapéptido)-NAG • La reiteración de transglucosidación va generando cadenas largas de PG naciente unido por un extremo a bactoprenol

11. Fase 4: transpeptidación: creación de PG entrecruzado • El PG naciente (con sus pentapétidos) unido al bactoprenol reacciona por transpeptidación con un PG aceptor preexistente: • El –CO de la D-ala(4) reacciona con el NH2 libre del di-aa(3) • Entrecruzamiento entre dos cadenas de PG • Se libera la D-ala(5)

12. Detalle de la reacción de transpeptidación

14. Antibióticos que actúan sobre la biosíntesis del PG • Fosfomicina: inhibe la formación de NAM a partir de NAG • Cicloserina: inhibe la racemización de la Ala, así como la formación del dipéptido D-ala-D-ala • Tunicamicina: inhibe la traslocasa (2ª fase) • Vancomicina: inhibe transglucosidación (3ª fase) • Bacitracina: impide la regeneración del bactoprenol • ß-lactámicos: inhiben transpeptidación (fase 4ª: entrecruzamiento de cadenas de PG

15. Crecimiento de pared celular: papel de las autolisinas • Para que el PG crezca coordinadamente y se pueda formar el septo transversal, hay una serie de enzimas: “autolisinas” • Muchas autolisinas son sitios de acción de penicilinas BPBs • PBP1: síntesis de PG durante elongación • PBP2: crecimiento forma bacilar • PBP3: síntesis de PG en el tabique transv. • PBP4: hidrólisis entrecruzamientos en elongación • PBP5: destrucción pentapéptido no entrecruzado

16. Crecimiento pared en Gram-negativa (E. coli) • Crecimiento en longitud (elongación) •  la célula crece en tamaño • Producción del tabique transversal (septación) •  formación de 2 células hijas

17. Elongación de la pared en Escherichia coli • Las PBPs1 se encargan de la elongación del PG naciente: • Transglucosidación de uu. disacarídicas • Transpeptidación entre tetrapéptidos de cadenas adyacentes • Las cadenas nacientes de PG se intercalan en el PG preexistente: • PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG previo • PBP2 interviene en la transpeptidación • La elongación se hace en la parte cilíndrica de la célula, en forma dispersa (˜200 puntos)

18. Septación de la pared en Escherichia coli • Ensamblaje del “divisoma” por debajo de la membrana, en el centro del bacilo (modelo aún hipotético): • FtsZ (parecida a tubulina) se ensambla, formando un “anillo citocinético” que “tira” de las envueltas hacia el interior • Luego se activa la PBP3(=FtsI), una transglucosidasa/transpeptidasa del septo • Otras proteínas Fts

19. Crecimiento y septación de PC en Enterococcus faecalis • El crecimiento de la PC es zonal: comienza en centro y avanza hacia fuera • Célula adulta con banda ecuatorial donde la PC se hace más gruesa • Debajo de este engrosamiento, se va depositando nuevo material de PC. Aparece una muesca en banda ecuatorial • El tabique (doble grosor de PC normal) avanza... • ... hasta que se completa • El tabique de doble grosor se escinde simétricamente por autolisinas

20. Crecimiento zonal de la PC del Enterococcus faecalis

21. Protoplastos y esferoplastos • En laboratorio se pueden lograr células desprovistas total o parcialmente de PC • Protoplastos: células procarióticas carentes totalmente de pared celular • Esferoplastos: células procarióticas carentes parcialmente de pared celular

22. Métodos de obtención de protoplastos y esferoplastos • Por destrucción del PG con lisozima o peptidasas • En Gram-negativas hay que desorganizar antes la membrana externa con el agente quelante EDTA (secuestra cationes) • Por inhibición de la formación de nuevo PG en células en crecimiento • Ej.: tratando las células con penicilina

23. Protoplastos y esferoplastos son osmóticamente sensibles

24. Suspensiones estables de protoplastos y esferoplastos • Hay que obtenerlos en un medio isotónico o ligeramente hipertónico: • NaCl 0.25-0.5 M • Sorbitol o sacarosa 0.5-1.0 M • Polietilenglicol (PEG) al 7.5% • En estos medios protoplastos y esferoplastos tienen formas esféricas, cualquiera que fuera la forma original de la bacteria • En medios adecuados, protoplastos y esferoplastos pueden regenerar la PC

26. ¿Para qué sirven los protoplastos y esferoplastos? • Método suave de obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares • Para hacerlas permeables a ADN, en experimentos de transformación artificial (ej.: en ingeniería genética) • Fusión de protoplastos (para obtener recombinantes somáticos)

27. Formas L • Formas L naturales: • Carentes totalmente (o casi) de PC que algunas bacterias generan espontáneamente en medios a base de suero (que son hipertónicos) • Ejemplo: Streptobacillus moniliformis • Colonias en forma de “huevo frito” • Formas L inducidas: tratamiento con penicilina en medio hipertónico • L inestables: tratamiento breve; revierten PC • L estables: tratamiento prolongado; no revierten PC