核黄素（维生素 B2 ）

1. 怎样检测样品中的核黄素（维生素B2）？ 核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末 饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。

2. 第五章分子荧光分析法 molecular fluorescence analysis 郭建丽 卫生化学教研室

3. 第一节概述 荧光的发现 植物愈创木切片黄色 水溶液 ——天兰色荧光；

4. 荧光的发现

6. 磷光 光致发光 荧光 物质分子吸收光能后，其电子由基态 跃迁到激发态，激发态的分子以电磁 辐射的形式释放能量回到基态，称为 光致发光 受光激发的分子从第一激发单重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。 受光激发的分子从第一激发三重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。

7. 分类 (1)Ｘ射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光(激发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)

8. 特点 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 2～4个数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便

9. 第二节基本原理 一、分子荧光产生过程 二、激发光谱与荧光光谱 三、荧光物质的分子结构 四、荧光强度与溶液浓度的关系 五、影响荧光强度的外部因素

10. 一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁 S1 S0

11. 2. 单重态与三重态 处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。

12. 传递途径 3.激发态→基态的能量传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁 荧光 延迟荧光 磷光 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫

13. internal conversion internal conversion vibrational relaxation S2 intersystem crossing S1 T2 T1 energy fluorescence phsophorescence external conversion absorption vibrational relaxation S0 l3 l2 l 1 l 2

14. 二、激发光谱和荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum 激发光谱 荧光光谱 荧光波长 激发波长

17. 2.三维荧光光谱

18. 3.荧光光谱的特征 （1）荧光光谱的形状与激发波长无关 (2）荧光光谱比激发光谱波长长 （3）镜像对称

19. internal conversion internal conversion vibrational relaxation S2 intersystem crossing S1 T2 T1 energy fluorescence phsophorescence external conversion absorption vibrational relaxation S0 l3 l2 l 1 l 2

20. 4 3 2 1 S1 S0 4 3 2 1

21. 三、荧光与物质分子结构的关系relation between fluorescence and molecular structure 1.荧光发射的量子产率 分子产生荧光必须具备的条件： （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：

22. 激发 发射 2.化合物的结构与荧光 （1）跃迁类型：* → 

23. (2) 共轭效应 化合物 λ/nm 苯 0.07 283 萘 0.29 321 蒽 0.46 400 一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且荧光光谱红移。 强荧光 无荧光

24. （3）刚性平面结构 刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。

26.  吸电子基团：如–COOH, , –NO2, –NO等， 减弱甚至熄灭荧光。 (4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度 苯 10 苯酚 18 苯胺 20 苯甲酸 3 硝基苯 0 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等，增强荧光。

27. 四、 荧光强度与溶液浓度的关系 根据Lambert-Beer定律： 所以，

28. 由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程度及荧光效率成正比，即：由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程度及荧光效率成正比，即： 当abc≤0.05（即溶液很稀）时， 对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，

29. 五、影响荧光强度的外部因素relation between fluorescence and molecular structure 1.溶剂的影响 2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭 pH<2 无荧光 7~12 蓝色荧光 >13 无荧光

30. 造成荧光熄灭的原因： （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭： （4）荧光物质的自熄灭： （5）内滤光作用和自吸现象

31. 5.散射光（scattering light） （1）瑞利（Reyleigh）散射光 （2）拉曼（Raman）散射光 瑞利峰 拉曼峰

32. 第三节荧光分析仪器instrument offluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型

33. I0 It F

34. 一、仪器的主要部件 激发光源(light source) 样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)

35. 卤钨灯 激发光源 激发光源:能够在紫外-可见光区连续发光， 常用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源.

36. 高压汞灯

37. 高压氙灯

38. 样品池

39. 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 荧光分光光度计 样品池 It It IF,p I0 I0

40. 狭缝 混合光 准 直 镜 色散原件 单色光 狭缝 单色器 • 滤光片、棱镜、光栅

42. 检测器 光电池或光电倍增管,光电二极管阵列式检测器

44. 激发单色器 光源 氙灯 样品池 光电倍增管 问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？ 数据处理 仪器控制 发射单色器

45. 激发 单色器 光源 样品池 发射 单色器 数据处理 仪器控制 光源 单色器 样品池 检测器 数据处理 仪器控制 检测器 紫外-可见分光光度计: 荧光(磷光)分光光度计:

46. 二、仪器类型 1. 荧光光度计(fluorometer) 2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer)

48. 样品 第一滤光片 表面 吸收 物质 光源 样品池 激发 单色器 光源 程序 狭 缝 狭缝 第 二 滤 光 片 发射 单色器 指示器 信号输出 检测器 检测器 放大器 荧光计示意图 记录器 荧光分光光度计示意图

49. 可获得三维光谱图的仪器如：日立4500型荧光分光光度计。可获得三维光谱图的仪器如：日立4500型荧光分光光度计。 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图

50. 第三节荧光分析方法与应用fluorescence analysis and application 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。