2. laboratorijas darbs. Genomiskās DNS izdalīšana, centrifugēšana.

1. Studiju kurssIevads molekulārajā un šūnas bioloģijā Bloks Dzīvības ķīmija, molekulārā bioloģija 2. laboratorijas darbs. Genomiskās DNS izdalīšana, centrifugēšana. Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Genoma organizācija Cilvēks 2n = 46 pavisam 24 atšķirīgas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Genoma organizācija Prokariotiem raksturīgi: nosacīti 1 hromosomas 1 kopija šūnā (haploīds genoms) Plazmīdas, episomas - var nebūt / var būt, - ja ir - viena veida vai vairākas dažādas, - kopiju skaits mainīgs. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Cik genoms liels ? Haploidāls cilvēka genoms ~ 3x109 bp Haploidāls vistas genoms (33 hromosomas) E. colihromosoma Haploidāls egles genoms Amēbas genoms (~ 500 hromosomas, domājams poliploīdija) ~ 1x109 bp ~ 4x106 bp ~ 1x1010 bp ~ 7x1011 bp LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Genoma organizācija Vista 2n = 62 - 78 pavisam 33 atšķirīgas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Cik daudz materiāla vajag ? Vienā diploidā cilvēka šūnā - 6,6 pg (6,6x10-12g) DNS Vienā E. coli šūnā - 5,0 fg (5,0x10-15g) DNS Lai iegūtu 50 mg DNS, vajadzētu: ~107 cilvēka šūnu (apmēram, 1 - 2 ml asiņu) ~1010E. coli šūnu (apmēram, 2 ml tipiskas E. coli naktskultūras) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Cik daudz materiāla vajag ? Reālais DNS iznākums parasti mazāks, piemēram: ~2 mg DNS no 1 g zīdītājdzīvnieku audiem, 10 - 40 mg DNS no 1 g augu materiāla, 5 - 20 mg DNS no 1 ml baktēriju kultūras ~20 mg DNS no 1 ml cilvēka asiņu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Genoma organizācija LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. DNS izdalīšana 1. Bioloģiskā materiāla iegūšana. 2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska. 3. Šūnu noārdīšana (lizēšana) - mehāniska, ķīmiska. 4. DNS atdalīšana no citiem savienojumiem. 5. DNS izgulsnēšana un šķīdināšana. 6. DNS papildus attīrīšana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Audu dezintegrēšana Nažu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar rotējošiem nažiem. Lieto audu gabalu homogenizēšanai. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Dounča homogenizators. (Dounce homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšanai. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Potera homogenizators. (Potter [Elvehjem ]homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Lodīšu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar lodītēm vibrējošā kapsulā. Materiālu parasti iesaldē. Lieto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija). Straujās svārstības vidē veiksmīgi iedarbojas uz šūnām un audu gabaliņiem, radot spēcīgu bīdes deformāciju. Jāuzmanās no pārmērīgas parauga sasilšanas un putošanās - veic ledus vannā. Šūnu un audu suspensijā, notiek arī DNS fragmentācija. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Frenča presse. (French Press) Šūnas ar lielu spiedienu tiek dzītas cauri smalkai sprauslai. Pielieto mikroorganismiem ar šūnapvalku (baktērijas, aļģes, raugi) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Homogenizēšana ar stikla daļiņām. Materiālu ilgstoši, pēc noteiktas programmas maisa kopā ar stikla vai citām abrazīvām daļiņām. Lieto audu kultūru, baktēriju suspensijām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Šūnu lizēšana Lizēšanas buferos parasti ietver: SDS 1,0 - 0,5% Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloidālas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām. Gatavo 10% izejas šķīdumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Nātrija dodecilsulfāts SDS LD50 / orāli / žurkai = 1 288 mg/kg kairina ādu, gļotādasXi NaC12H25SO4 Nātrija laurilsulfāts SLS (sadzīves ķīmijā) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. SDS Pussintētiska viela, ko pamatā iegūst no eļļas palmu augļu un kokosriekstu eļļas (bagātas ar laurilskābi). Ūdens šķīdumiem bāziskas īpašības (pH 9-10). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. SDS Pielietojums: - Audu un šūnu ķīmiska noārdīšana (P., nukleīnskābju izdalīšana), - Proteīnu denaturēšana gelelektroforēzē, (~1 SDS molekula uz 2 aminoskābju atlikumiem) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. SDS SLS kā deterģents plaši tiek lietots arī sadzīves ķīmijā: - šampūni, - tehniskie mazgāšanas līdzekļi, - šķidrās ziepes u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris LD50 / orāli / žurkai = 5 900 mg/kg kairina ādu, gļotādas Xi Sintētiska viela (~1940) ar bāziskām īpašībām (pH ~ 10,5) Tris(hidroksimetil)aminometāns; Trometamīns; Trizma u.c. C4H11NO3 (HOCH2)3CNH2 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris H+ Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955) pH 6,5 - 8,5 titrējot ar dažādām skābēm, visbiežāk HCl => Tris - HCl Bieži lietotās pH vērtības: 6,7 7,0 7,5 8,0 Gatavo 2M izejas šķīdumu ar vajadzīgo pH LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Etilendiamīn- tetraetiķskābe EDTA EDTA - Etilendiamīn-N,N,N',N'-tetraetiķskābe C10H16N2O8 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. EDTA Etilendiamīn- tetraetiķskābe LD50 / orāli / žurkai = 2200 mg/kg Sintētiska viela (~1935) ar maz izteiktām skābes īpašībām. EDTA skābes formai maza šķīdība ūdenī (~0,5g/l), tādēļ parasti lieto tās sāļus ar vienvērtīgajiem katjoniem. Visbiežāk izmanto dinātrija sāli (Na2EDTA), kura ūdenī šķīst daudz labāk. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. EDTA EDTA Savienojums labi saista divvērtīgo metālu jonus (Ca++, Mg++), kuri nepieciešami nukleāžu un citu hidrolītisko enzīmu aktivitātei. Pievieno arī asins paraugiem uzglabāšanas laikā kā pretrecēšanas līdzekli, jo tas saista asins recēšanai nepieciešamos Ca++ jonus (EDTA vakutaineri). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. EDTA Plašāks pielietojums - kā ūdens mīkstinātājs un dažādu daudzvērtīgo metālu jonu helators rūpnieciskajos un ūdens attīrīšanas procesos; EDTA sāļi arī kā pārtikas piede- va - stabilizators (E385; E386); Medicīnā kā pretinde saindējo- ties ar smago metālu sāļiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. DNS attīrīšna Bieži tiek lietota šūnu lizātu vai iegūto NS šķīdumu organiskā ekstrakcija, kurā parasti izmanto fenolu, hloroformu vai abu vielu maisījumu. Tā palīdz paraugus atbrīvot no lipofīlām vielām un proteīniem, tos denaturējot. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Organiskā ekstrakcija. Lieto ar ūdeni piesātinātu fenolu;Fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu; (25:24:1) Hloroformu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. Ūdens fāze Denaturētie proteīni Organiskā fāze Organiskā ekstrakcija. Vorteksējot izveido abu fāzu emulsiju, lai palielinātu fāzu saskares virsmu.Centrifugējot fāzes atdalās, starp tām paliek denaturētu proteīnu slānis. DNS atrodas ūdens fāzē, to atsūc un pārnes uz jaunu stobriņu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Centrifugācija Centrbēdzes (centrtieces) spēks Fc = mac - m - ķermeņa masa, - ac - centrbēdzes paātrinājums. Fc Fb LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. RCP Relatīvais centrbēdzes paātrinājums (RCP): arc = 1,119*10-5*n2*r n - griešanās ātrums (apgr./min.) r -griešanās rādiuss (cm) arc- relatīvais centrbēdzes paātrinājums - - rāda, cik reizes tiek pārsniegts g LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Centrifugācija. centrifugācija supernatants nogulsnes LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. “Vortex” maisītāji LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Centrifūgas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. Centrifūgas Vāks LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Centrifūgas LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. DNS izgulsnēšana Lai atbrīvotos no dažādiem: - neorganiskiem sāļiem, - deterģentiem, - mazmolekulārajiem org. savienojumiem; un palielinātu DNS koncentrāciju, veic DNS izgulsnēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. DNS izgulsnēšana Izmanto lielmolekulāro NS īpatnību - NS šķīdība būtiski samazinās: 50 - 60 % spirtu šķīdumos, īpaši monovalento katjonu (Na+, K+, Li+) klātbūtnē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. DNS izgulsnēšana Izgulsnēšanai lieto 96o vai 100o etanolu tilpuma attiecībās 2:1 (pirmais cipars - spirta tilpums) vai Izopropanolu tilpuma attiecībās 0,6:1 - 1:1 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. DNS savākšana DNS efektīvāk izgulsnējas no koncentrētiem DNS šķīdumiem, kuros DNS pavedieni viegli sastop viens otru, saķeras kopā un veido lielus precipitātus. Optimālā gadījumā visa genomiskā DNS saķeras vienā lielā kamolā, kuru var izcelt no šķīduma ar stikla āķīti vai piesūcot pipetes uzgalim. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. DNS savākšana Ja veidojas daudzi sīki DNS precipitāti vai tos vispār nevar saskatīt, paraugs jācentrifugē. Bieži pēc genomiskās DNS sablīvēšanas, īpaši ja DNS ir daudz, rodas problēmas ar tās izšķīdināšanu. Labi izšķīst tikai īsie DNS fragmenti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. DNS attīrīšana Lai atbrīvotos no palikušām - neorganisko sāļu, - izopropanola, - fenola paliekām, veic DNS nogulšņu mazgāšanu ar 700 etanolu. Šādā etanola koncentrācijā DNS nešķīst, bet neorganiskie sāļi daļēji saglabā šķīdību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. DNS šķīdināšana Iegūto DNS šķīdina ūdenī vai mazas koncentrācijas buferšķīdumos (TE). DNS šķīšanas ātrums atkarīgs no fragmentu garuma. Pareizi izdalīta genomiskā DNS pilnībā izšķīst tikai pēc 12 - 24 stundām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML