Instrumentālās metodes bioģijā.

1. Instrumentālās metodes bioģijā. Elektroforēze 2013./2014. mācību gada 1. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Literatūra • Lekciju materiāli - \\Priede\Grozs\Mikrobiologijas\ Maris\InstrMet • Westermeier R. Electrophoresis in Practice; 1997, Wiley-VCH, Germany Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Literatūra Laboratorijas metožu krājumi. Piemēram, • Maniatis et al., Molecular Cloning. 1982, CSH • Short Protocols in Molecular Biology. Ed. in Chief Ausubel, F., 1995, Wiley Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Literatūra Tiek izdots žurnāls - Electrophoresis Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Elektroforēze Nozīmīga boķīmijas metode, lai raksturotu: - pētāmās makromolekulas - lādiņu, molekulmasu, telpisko apveidu; - to tīrību, - homogenitāti. Visbiežāk izmanto makromolekulu molekulmasas noteikšanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Elektroforēze Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Elektroforēze Elektroforēzes pamatā ir lādētu daļiņu pārvietošanās elektriskajā laukā. + + + Katods Anods Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Elektroforēze Visplašāk izmanto: - NS un - proteīnu raksturošanai. Šīm molekulām viegli piemeklēt vides apstākļus, kuros tām būtu pietiekami liels lādiņš. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Elektroforēze  - potenciālu starpība starp elektrodiem (V) l – attālums starp elektrodiem  l q E – elektriskā lauka intensitāte (stiprums) =/l (V/cm) F = Eq F=ma a=F/m=Eq/m + + Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Elektroforēze Ja tas notiktu vakumā, lādētās molekulas paātrinātos un ātri sasniegtu elektrodus. Vidē, kurā parasti veic elektroforezi, - viskozitātes dēļ, - starp molekulām notiekošo sadursmju dēļ Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Elektroforēze daļiņukustība ir apgrūtināta, - tā notiek lēnāk, - ir vairāk atkarīga no - daļiņas lieluma un - ģeometriskās formas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Elektroforēze Sfēriskas daļiņa viskozā vidē: Fb Fe Fb=6rv v=Fb/6r r - rādiuss  - šķīduma viskozitāte v – daļiņas kustības ātrums. v = Eq/6r + Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Elektroforēze Sfēriskas daļiņas viskozā vidē: v = Eq/6r Daļiņu pārvietošanās ātrums ir - tieši proporcionāls - elektriskā lauka stiprumam un - daļņas lādiņam - apgriezti proporcionāls - daļiņas izmēram un - vides viskozitātei. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Elektroforēze Sfēriskas daļiņa viskozā vidē: v = Eq/6r Tā kā molekulas viena no otras atšķiras ar savu - lādiņu un - izmēriem, tad pēc noteikta laika elektriskā lauka iedarbībā tās būs veikušas atšķirīgus attālumus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Elektroforēze Šie vienādojumi labi apraksta molekulu pārvietošanos viskozā cukuru šķīdumā, bet nav viennozīmīgi attiecināmi uz ierobežojošo gelelektroforezi. Šeit papildus notiek gela struktūras un molekulu mijiedarbības. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Elektroforēze Daļiņu kustības trajektorijas spēka līnijas potenciālu izolīnijas Daļiņas pārvietosies pa spēka līnijām. Tās ir perpendikulāras potenciāla izolīnijām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Elektroforēze Lai iegūtu labu paraugu sadalījumu, nepieciešamas elektriskais lauks ar paralēlām spēka līnijām Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Elektroforēze v = Eq/6r Lai precīzāk raksturotu daļiņu, neatkarīgi no pieliktā elektriskā lauka intensitātes, ieviests lielums - Relatīvā elektroforētiskā mobilitāte -  µ = v/E = q/6r Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Elektroforēze Barošanas avoti Ja ir atbilstošs barošanas bloks var lietot Oma likumu I=U/R Pretējā gadījumā spēkā ir Oma likums slēgtai ķēdei. E=/l kameras Ugelam=E*lgelam Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Elektroforēze Īpatnējā elektriskā pretestība (ro)  (*m) [ I=U/R] R=l/S Atkarīga no: - elektroforezes vides, - temperatūras, - notiekošajiem elektroķīmiskajiem procesiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. Elektroforēze Temperatūra atkarīga no jaudas un siltuma apmaiņas (dzesēšanas) P=I*U Ja U ir konstants, jāseko arī I, jo - nevienmērīgi sasilusi vai - pārkarsusi vide Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. Elektroforēze Temperatūra rada - smaidīšanas efektu, - var bojāt elektroforēzes vidi un gelu, - denaturēt, pārveidot pētāmās molekulas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Elektroforēze Barošanas avoti regulējas pēc U, I, P, (t°) Elektrisko lauku rada pieliktā potenciālu starpība vai spriegums. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Elektroforēze U izvēle pēc attāluma starp elektrodiem. parasti E = 5 - 10 V/cm I limits – lai būtiski nepalielinās temperatūra Var izmantot - labu dzesēšanu - mazu gela / bufera slāņa šķērsgriezuma laukumu, - mazu bufera jonu spēku (liela pretestība). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. Elektroforēze Bufera jonu spēku var samazināt, kamēr to pieļauj buferējošā kapacitāte. Elektrolīzs laikā mainās H+ jonu koncentrācija. AnodsKatods H2O –2e => 2H+ + O0 2H2O +2e => 2OH- + 2H0 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Elektroforēzes vēsture + Pirmās elektroforēzes tika veiktas U veida caurulēs, cukuru šķīdumos. Pētāmo vielu sadalījuma atšifrēšana bija sarežģīta un sadalījums nestabils. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. Elektroforēzes vēsture Metodi 1937. gadā ieviesa zviedru ķīmiķis Arne Tiselius. (1902 - 1971) Panākumi tika atzinīgi novērtēti. 1948. gadā saņem Nobela prēmiju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. Elektroforēzes vēsture Lai būtu vieglāk saglabāt vielu sadalījumu, sāka lietot nesējus: - papīru un - cietes gelus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Elektroforēzes vēsture Taču arī šie nesēji deva diezgan nekvalitatīvu ainu. Vēlāk izrādījās ka labākie nesēji ir: - agarozes un - poliakrilamīda geli. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. Elektroforēzes vēsture Brīvās plūsmas elektroforēze (FFE) (1982) Preparatīva metode. Ļauj frakcionēt ne tikai - molekulas, bet arī - organellas no audu homogenizātiem, - noteiktas šūnas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Buferaplūsma FFE Brīvās plūsmas elektroforēze (1982) Pa 0,5 – 1 mm platu spraugu starp dzesējamām stikla platēm, perpendikulāri elektriskajam laukam plūst buferšķīdums. Otrā galā tas tiek savākts vairākos stobriņos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. FFE Brīvās plūsmas elektroforēze (FFE) (1982) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. FFE ProMetHEUS FFE™ sistēma Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. FFE OCTOPUS FFE sistēma Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Elektroforezes vēsture Micelārā elektrokinētiskā hromatogrāfija - MEKC(1984) Apvienotas HPLC un CE labākās īpašības, līdz ar to var labi sadalīt gan lādētas daļiņas gan daļiņas bez lādiņa. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. Elektroforēze nesējos Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Elektroforēze nesējos Pēc molekulu sadalīšanās principa izšķir: - zonālā elektroforēze, - izotaho elektroforēze, - izoelektriskā fokusēšana. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. Elektroforēze nesējos Zonālā Katra veida molekulas “nes” bedrītes attēlu. pH konstants vide - bufersistēma + nesējs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Elektroforēze nesējos Zonālā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. Elektroforēze nesējos Izotahoforeze Pārtraukta buferu sistēma + nesējs => ir vadošie joni ar lielu mobilitāti, un terminējošie joni ar mazāku mobilitāti nekā analizējamajām molekulām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. Elektroforēze nesējos Izotahoforeze Starp abiem buferiem uznes paraugu. Visu forezes laiku paraugs paliek uz robežas starp abām vidēm. Visas parauga sastāvdaļas pārvietojas kopā, bet sakārtojas atbilstoši lādiņam vai molekulu izmēram. Notiek zonu sakoncentrēšanās. T T V V Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. Elektroforēze nesējos Izoelektriskā fokusēšana (IEF) ir elektroforeze pH gradientā, kas izveidots starp katodu un anodu. 10 7 3 pH gradients Vides pH stabilizē amfolīti vai imobilīni Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. IEF Pie pH vērtībām, kuras mazākas par proteīna pI vērtību, to molekulas ir lādētas pozitīvi, bet pie pH vērtībām, kuras lielākas par proteīna pI vērtību, to molekulas lādētas negatīvi. pI=8+pH=7pI=6 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. IEF Ja pI=pH, proteīna molekula zaudē lādiņu un uz elektrisko lauku vairs nereaģē. pI=7pH=7pI=7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. Nesēji elektroforēzei Retāk tiek izmantots - papīrs un - plānā slāņa nesēji. Tajos - sadalīšana notiek sliktāk un - uznesamā parauga tilpums ir ierobežots. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. Nesēji elektroforēzei Papīru un plānā slāņa nesējus izmanto lielmolekulāru - polisaharīdu un - lipopolisaharīdu analīzēm, Jo tie viegli aizsprosto hidrofīlo gelu poras. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. Nesēji elektroforēzei Celulozes acetāta membrānas mēdz lietot klīniskajā praksē. Piemēram, seruma proteīnu analīzē. Ar tām darbošanās ir vienkāršāka, taču iegūtās zonas ir stipri difūzas un ļauj spriest tikai par galvenajiem parauga komponentiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. Nesēji elektroforēzei Ideāls materiāls nesējam: - vienāds, stingri noteikts poru izmērs, - ķīmiski inerts, - ar ierobežotu elektroosmozi, - mehaniski izturīgs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Cietes gels Cietes gels(1955) Gatavo no daļēji hidrolizētas kartupeļu cietes, - 5 –10 mm biezs, - poru izmēru nosaka cietes koncentrācija. - Rezultātiem slikta atkārtojamība; - ar gelu grūti apieties mehāniskās neizturības dēļ. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

50. Cietes gels Cietes gels(1955) Joprojām nedaudz izmanto - izoenzīmu pētījumos un - klīniskajā diagnostikā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML