实验三 核酸 (DNA 和 RNA) 的细胞核定位观察 p220

1. 实验三核酸(DNA和RNA)的细胞核定位观察 p220

2. 作业： 1、说明DNA和RNA的亚细胞定位在哪里?为什么？ 2、解释一下本实验中设立对照组的必要性是什么，三氯乙酸和丙酮各起什么作用

3. 实验原理 Unna染色法 • 主要成分：甲基绿-派洛宁混合染料（碱性染料） • 原理：核酸是酸性的，它们对于碱性染料具有亲和力，但是DNA和 RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来

4. “样品的固定” 王金发 书 p37 目的： 迅速杀死细胞，稳定细胞的化学成分，以便在后面的处理、切片时不被破坏。 固定使得细胞大分子交联而保持在一定位置上，不至于在后面的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。 常用的固定液：(醛类：甲醛、戊二醛)

5. Unna染色法实验步骤 Unna 法 撕取洋葱内表皮 ↓ 小离心管Carnoy固定剂 15 min ↓ 95%酒精复水5 min ↓ 70%酒精复水5 min ↓ H2O 5min ↙ ↘小离心管 表面皿中实验组 对照组→ 5% 三氯乙酸（TCA） ↙ 90℃保温,15min H2O 5min ↙ Unna 染液 20min(室温) ↓ H2O漂洗几秒后 丙酮 分色6-10Sec ↓ H2O洗片刻 ↓ 水压片分别镜检观察

6. 背景知识 • 核酸是一种线形多聚核苷酸，它的基本单位是核苷酸。细胞核内存在有两种核酸：DNA和RNA，它们具有类似的化学组成，即均由含氮碱基，戊糖和磷酸组成，可表示如下: 磷酸 核糖（RNA） 核酸 核苷酸 戊糖 脱氧核糖（DNA） 核苷 A、G、C、U (RNA) 碱基（嘌呤/嘧啶） A、G、C、T（DNA）

7. DNA是染色体的主要成分，在细胞核内呈双螺旋结构。DNA是染色体的主要成分，在细胞核内呈双螺旋结构。 • RNA是单链线形，主要有三种类型: 核糖体RNA (rRNA) 转运RNA（tRNA) 信使RNA（mRNA) rRNA含量大，占细胞RNA总量的80％左右，是核糖体的重要组成部分，而rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配都是在核仁中进行的。 tRNA约占全部RNA的15％，它在蛋白质生物合成过程中具有转运氨基酸的作用。 mRNA的含量最少，只占5％左右，它是以DNA为模板合成的，它又是蛋白质合成的模板。

8. rRNA基因的转录• 快速生长的哺乳动物细胞中(培养的Hela细胞), 转录生成的RNA总量的80%-rRNA; 15%-tRNA; 编码蛋白质的mRNA量少• 处于生长中的高等真核细胞一般需107核糖体以确保蛋白质的合成, so真核细胞中有关编码核糖体基因(ribosomal gene)会在染色体的核仁区以100-5000个重复copy串联成中度重复序列, 成簇分布在少数特定染色体的核仁区。

9. The general structure of ribosomes in prokaryotes and eukaryotes rNTs: number of ribonucleotides

10. The macromolecular composition of a mammalian ribosome

11. Structure of T. thermophilus 70S ribosome as determined by x-ray crystallography Small ribosomal proteins, dark gray; Large ribosomal proteins, light gray

12. 核仁 Light micrograph of an isolated nucleus from a Xenopus ootyte stained to reveal the hundreds of nucleoli.

13. A section of part of a nucleus with a nucleolus 纤维中心(FC)：位于核仁中央，低电子密度、染色浅， rRNA基因的储存位点。 稠密区(DFC)：电子密度最高，由致密的纤维构成，一般见不到颗粒；含正在转录的RNA分子。 颗粒区(GC)： 位于周边，直径为15-20nm的核糖核蛋白颗粒(RNP)-代表已合成的核糖体亚单位前体颗粒。

14. 核仁(nucleolus) 重要功能 rRNA合成加工 • rRNA基因转录 • rRNA前体的加工 核糖体大小亚单位各自的装配 rRNA是核糖体的重要组成部分,而rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配都是在核仁中进行的。