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Manipulación y determinación de estructuras de proteínas.

Manipulación y determinación de estructuras de proteínas. Curso de Bioquímica 2002 Dr. Enrique Rudiño-Piñera. 7606 Factores de estructura 1359 Archivos con restricciones de RMN 8965. ¿COMO DETECTAR LA POSICIÓN DE CADA ÁTOMO?.

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Manipulación y determinación de estructuras de proteínas.

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Presentation Transcript

  1. Manipulación y determinación de estructuras de proteínas. Curso de Bioquímica 2002 Dr. Enrique Rudiño-Piñera

  2. 7606 Factores de estructura 1359 Archivos con restricciones de RMN 8965

  3. ¿COMO DETECTAR LA POSICIÓN DE CADA ÁTOMO? • Necesitamos medir una señal que detecte la posición de cada átomo individual (que interaccione con cada átomo) • debemos procesar la señal de la proteína completa y conseguir individualizar a partir de ella la posición de cada átomo • debemos tener una señal de suficiente intensidad para poder descifrarla y encontrar los detalles suficientes para lograr determinar la estructura

  4. MÉTODOS DE DETERMINACIÓNCristalografíaResonancia magnética nuclear • Necesidad de obtener cristales • para eso se necesita una preparación extremadamente pura y conformacionalmente homogénea • posibilidad de resolución atómica • Estructura en solución • menor cantidad de macromolécula • se interpretan los datos a partir de las posibles conformaciones (menos datos = mayor incertidumbre en los resultados)

  5. Difracción de Rayos X

  6. Mapa inicial Ajustes manuales Modelo final Ajustes automáticos

  7. ONDAS ATRAVEZANDO UNA VENTANA l/d<<1 l d

  8. l/d>>1 Q DIFRACCIÓN DE ONDAS l d Q

  9. LA FUENTE

  10. RöntgenStrahlen 1895-Wilhem Röntgen tiene 50 años y es profesor de física, director del Instituto de Física y Rector de la Universidad de Würtzburg. *Experimenta en Rayos Catódicos, obtiene una donación de un tubo de rayos catódicos de Lenard. *Su proyecto era: Encontrar radiaciones de alta frecuencia generadas junto a los rayos catódicos y predichas por von Helmholtz +1metro Platinocianuro de Bario

  11. Cómo se generan los rayos X: ánodos rotatorios y sincrotrones Ánodo rotatorio Sincrotrón Espejos de rayos X

  12. EL OBJETO

  13. Proteína 2mL Precipitante 2mL Aceite Semipermeable H2O

  14. Un cristal se define por sus características físicas: a: Piezoelectricidad b: Cohesión c: Difracción, etc. Reloj de Cuarzo Lápiz Diamante El orden a pequeña distancia induce orden a larga distancia

  15. ¿Que pasa si cortas un cristal (en direcciones de cribado) y cada nuevo corte lo vez en el microscopio? Celda Unitaria 1X 5X 20X nX

  16. Red 3D C B A 3 magnitudes 3 ángulos

  17. Nomenclatura simétrica

  18. 1AOL b Triptasa Grupo Espacial P41

  19. 4/4 3/4 2/4 1/4 0 1AOL b Triptasa Grupo Espacial P41

  20. ¡MOMENTO LO ESTOY CARGANDO!

  21. a) one object d) two columns of objects, each as a)b) two objects, each as a) e) a two-dimensional lattice of objects, each as a) c) four objects, each as a) f) as e), with larger separation between objects

  22. Los cristales, después de crecidos, deben colocarse en el has de rayos X sin que se deterioren durante la medición

  23. Los detalles del mapa de densidad, que permiten ubicar cada átomo en su posición, son el resultado de medidas de alta resolución

  24. R E SOLUCION Resolución: Varia Todos los mapas se calcularon con contornos a 1s.

  25. Aquí los datos son todos a 1.65 Å de resolución, pero los valores de s cambian de la siguiente manera: 0.7 s - 1.0 s - 1.3 s -1.6 s y 2.1 s 0.7 s 1.0 s 1.3 s 1.6 s 2.1 s

  26. ¿Qu₫ se sabe de los Rayos X de 1895 a 1912? 1. Se pueden polarizar. 2. Existen los rayos X característicos. 3.Según varios investigadores su l esta entre 0.5 y 1.9A. 4.Hay división entre: ¿onda o partícula? Caf₫, Esquí, Físicos, Estudiantes de doctorado y Ocio Difracción de rayos X

  27. Universidad de Munich Lab. de Röntgen Inst. de Física Teorica Inst. de Mineralogia Director Sommerfeld Inv. Max von Laue Asociado W. Friedrich Est. Dr. Paul Ewald Est. Dr. Paul Knipping Inv. P. von Groth 1. Laue discute con Ewald sobre la tesis de este último, Laue esta escribiendo un capitulo sobre ondas electromagn₫ticas para la enciclopedia que edita Sommerfeld. 2. Laue y Sommerfeld esquiando en los Alpes ”la vibración t₫rmica de los átomos produciría una red muy desordenada para difractar los rayos X” 3. Laue, Sommerfeld, Knipping, Friedrich y von Groth en el caf₫ Lutz de Munich.

  28. Placa Cristal Sulf. de Cobre 1er experimento Fte. Rayos X Sulf. de Cobre 2do experimento Fte. Rayos X Cristal

  29. Conclusiones: 1. Los Rayos X tienen l 1000 veces menor que la luz visible. 2. Los cristales son redes tridimensionales regulares. 3. Laue explica el fenómeno derivando la difracción de 1D a 3D. Laue Recibe el Nobel de Física de 1914, lo recibe en 1920.

  30. 2q ¿Pueden los rayos X ser reflejados por los planos atómicos del cristal?

  31. l l q q d d q q q q l = 2d sen q Sigue la analogía de la luz blanca sobre un espejo.

  32. q Pero podía medir , pero no conocía ni l ni d! 1. Difractó cristales de NaCl, KCl, KBr y KI 2. Uso el modelo de Pope y Barlow 3. Midió la densidad del cristal de NaCl r = m/v ; v=m/r 4. Ahora conocía el V de la celda Unitaria si en una celda cubica (d/l)3 = V/l3 entonces: d = V 1/3 y Concluyo que l = 1.10 A y que la distancia Na.Cl es 2.8A l = 2d sen q l = 2V 1/3 sen q

  33. ¿Pero con que detector midió la difracción? .paralelamente su padre invento el espectrómetro de ionización!!!!, y probo que la energía de los rayos X era igual a la de los electrones usados en el tubo de rayos catódicos. Juntos: 1. analizaron los espectros de los rayos X generados por: Pt, Os, Ir, Pd, Rh, Cu, Ni, etc. 2. Resolvieron la estructura de la fluorita (CaF2), la blenda (ZnS), la pirita (FeS2) y el Diamante (Cn). 3. Prueban que los trabajos teóricos de Barlow y Fedorov son reales. 4. Reciben el premio Nobel de física en 1915.

  34. “La materia está constituida de partículas indivisibles denominadas átomos que pertenecen a un número finito de clases distintas. En la realidad, solo existen los átomos y el vacío, lo demás es convención” 1912-1950 1916- Debye y Scherrer descubren el m₫todo de polvos. 1928-Kathleen Lonsdale resuelva la estructura del hexametilbenceno, Kekule descansa en paz. 1934- Linus Pauling escribe “El enlace Químico”. ..y las macromoleculas? 1920-1 as evidencias de que las proteínas cristalizan. 1949-Karle y Hauptman inventan los metodos directos (Nobel 1985). 1950Žs-Perutz y Kendrew: Hemoglobina -Watson, Wilkins y Crick: ADN

  35. Macromol₫cula Pura Cristalizarla Difractar Determinar distancia entre planos Calcular la celda Encontrar el grupo espacial (Fedorow, Barlow y Schonflies) Encontrar la fase (Metodos directos, MIR, MR, MAD) Pensar, pensar y pensar Ajustar el modelo Construir un modelo

  36. Resultado cristalográficoCómo traducirlo en términos biológicos

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