许冰莹, Tel:0871-65922837； 13769175605 Email:bingying_xu@126

1. 许冰莹, Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院

2. DNA多态性 在基因组DNA中，不同碱基结构的等位基因所形成的多态性称为DNA多态性。 DNA长度多态性 DNA序列多态性 差异表现在DNA片断长度上 差异表现在DNA碱基序列上

3. 第六章 DNA序列多态性 第一节DNA序列测定及多态性分析 第二节等位基因特异性探针杂交技术 第三节限制性片段长度多态性 第四节MVR-PCR序列多态性

4. 教学内容和目的要求 1 掌握DNA序列测定及多态性分析 2 了解等位基因特异性探针杂交技术 3 • 了解限制性片段长度多态性 了解MVR-PCR序列多态性 4

5. 概述 人类基因组DNA碱基序列差异--不同个体间 最本质的遗传差异。 DNA序列多态性(sequence polymorphism) 在特定的基因座上不同个体的等位基因之 间由碱基序列差异构成的DNA多态性。

6. 概述 DNA测序技术发展历史

7. DNA自动测序

8. 概述 DNA序列分析技术 1.DNA序列测定 2.限制性片段长度多态性 3.序列特异性PCR技术 4.MVR-PCR技术 5.SSCP技术

9. 第一节DNA序列测定及多态性分析 DNA测序(DNA sequencing): 对DNA分子的一级结构的分析 。 经典DNA序列测定技术： Sanger双脱氧核苷酸链终止法 DNA循环测序

10. 一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ） 1.原理（Principle） 在DNA合成时，在PCR反应体系中加入双脱氧核苷三 磷酸(2′, 3′- ddNTP),它与dNTP竞争掺入到新生的 DNA链上， ddNTP使链终止。

11. 一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ） 1.原理： 设置A、C、G、T 4种PCR反应体系，在4种反应体系 中分别加入ddATP、ddCTP、 ddGTP、 ddTTP,其他试剂 相同，在Taq DNA聚合酶作用下，生成具有相同的5′ 末端，而3′末端不同的DNA片段的混合物,经电泳分 离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。

12. 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图

13. What’s in the A Tube? 5’ 3’ Target DNA 3’ 5’ A dNTP+ ddATP B primers Mg2+ 10xPCR buffer Mg2+ Mg2+ Taq DNA polymerase Mg2+ Mg2+ Mg2+

16. 脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较 少一个－OH

17. P R P R P R P R P R P R Sanger’s Method: How Terminated 2- 5’ 1 PO4 A 5’ A 1 2 2 3’ OH 3’ H H 5’ ddNTP Terminated Normal Linking Phosphodiester bond 3’ dideoxynuceotide Can not react Juang RH (2004) BCbasics

18. 2.Sanger双脱氧核苷酸链终止法基本技术流程（The basic technical process） 同位素 链延伸 primer 链终止 测序 变性电泳 显带 dNTP、ddNTP 放射 自显影 电泳 分离 PCR 测序 反应 PCR扩增 DNA测序模板 单链DNA 碱变性DNA

19. 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法（Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method） （1）准备DNA模板 单链DNA和碱变性的双链DNA。 （2）dNTP标记物 32p,生物素，碱性磷酸酶 （3）DNA聚合酶 DNA聚合酶Klenow片段，5’ 3’聚合酶活性和 3’ 5’外切酶活性，校正引物3’端错配碱基。

20. 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法（Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method） （4）测序反应设置4个反应管A、C、G、T： A管：dNTP+ddATP C管：dNTP+ddCTP + G管：dNTP+ddGTP T管：dNTP+ddTTP 引物、buffer、 DNA聚合酶Klenow片段

21. 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法（Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method） （5）反应循环条件 55 ℃ 30min,放室温使模板与引物退火并延伸 （6）聚丙烯酰胺凝胶电泳 8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（8mol/L尿素），4个反 应管产物分别在比邻的4个点样槽加样。 （7）显带，从电泳谱带读出DNA序列。

22. Sanger双脱氧链终止法 （Sanger Dideoxy chain termination method）

25. How DNA Sequence Is Determined? 32P ATCGATCGAT ATCGATCGA ATCGATCG ATCGATC ATCGAT ATCG ATCGA AT ATC A 32P 32P 32P 32P 32P 32P 32P 32P 32P DNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis T A G C G C T A But these bands can’t tell us the identity of the terminal nucleotides If those band with the same terminal nucleotide can be grouped, then it is possible to read the whole sequence Juang RH (2004) BCbasics

26. 二.PCR循环测序技术（PCR cycle sequencing technology） 以双脱氧链终止法为基础的标准DNA测序方法。 采用热循环高效合成DNA，并结合双脱氧链 终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循 环中增加，称为循环测序。

27. 二.PCR循环测序技术（PCR cycle sequencing technology） PCR+双脱氧链终止法

28. 二.PCR 循环测序技术（PCR cycle sequencing technology） 步骤一 步骤二 PCR扩增靶序列制备测序模板，DNA 变性成单链 标记引物与其中的一条链上的互补序列 退火 基本原理 步骤 步骤四 步骤三 循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增 退火后的引物在DNA聚 合酶催化下发生链延 伸终止反应 PCR+双脱氧链终止法

30. PCR循环测序的优点 （The advantages of PCR cycle sequencing） 简单 易操作 DNA模板 用量少 减少二级结构 直接测序 效果好 A B C D

31. PCR循环测序与普通PCR反应比较

32. 双脱氧核苷酸链终止法与PCR循环测序法的比较 双脱氧核苷酸链终止法 PCR循环测序法 PCR循环 • 模板与引物 PCR热循环高效合成DNA 并结合双脱氧核苷酸终止法 • 双脱氧核苷酸链终止 • 电泳,放射自显影 32p-dATP 测序引物：32p-dATP 高效、快速

33. 三.DNA自动测序技术 （Automatic DNA sequencing technology） 采用荧光分子替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用四种荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。

34. 三.DNA自动测序技术 （Automatic DNA sequencing technology） 1.基本原理 荧光分子标记四种双脱氧核苷酸 Sanger双脱氧核苷酸链终止法 PCR循环测序 毛细管电泳 激光检测 计算机自动分析

35. 2.DNA自动测序技术的基本步骤 • 制备测序模板-PCR反应 • 测序模板的纯化与定量 • 测序反应--PCR仪（94 ℃ ，1min；60 ℃ ,30s；72 ℃ ,30s；20-40循环） • 测序反应产物纯化与变性 • 上样电泳--测序仪 • 分析结果

36. 3.DNA 自 动 测 序 技 术（Automatic DNA sequencing technology） 四种不同荧光标记ddNTP， PCR循环扩增在同一管中。 计算机自动分析结果 热循环反应 毛细管电泳 激光检测

37. 3.DNA 自 动 测 序 技 术（Automatic DNA sequencing technology） 用四色荧光标记ddNTP ddTTP ddCTP ddATP ddGTP 将四种荧光分子连在4种ddNTP ddATP●; ddTTP▲;ddCTP◆; ddGTP★;

38. 四色荧光染料(BigDye)标记终止物 将四种荧光分子连在4种ddNTP ddATP●; ddTTP▲; ddCTP◆; ddGTP★;

39. 测序反应体系和条件（Sequencing reaction system and condition）

40. 测序反应（ Sequencing reaction ）

41. 电泳检测（Electrophoresisdetection）—3130型遗传分析仪电泳检测（Electrophoresisdetection）—3130型遗传分析仪

42. 荧光检测（Fluorescence detection）

43. DNA自动测序结果（Automatic DNA sequencing results）

44. DNA自动测序结果（Automatic DNA sequencing results）

45. 3.DNA自动测序技术的特点（ characteristicsof Automatic DNA sequencing technology ） 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h

46. 双脱氧核苷酸链终止法与PCR循环测序法的比较 双脱氧核苷酸链终止法 DNA自动测序技术 PCR循环 • 模板与引物 PCR热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法 • 双脱氧核苷酸链终止 荧光标记ddNTP • 电泳放射自显影 高效、快速、自动化

47. 三种测序方法的比较

48. 第二节等位基因特异性探针杂交技术 （ allele specific oligonucleotide ，ASO） 一.概述 1.等位基因特异性寡核苷酸探针 根据等位基因的序列差异，设计并合成针对 不同等位基因的DNA探针。

49. 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) ★2.核酸分子杂交 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链(heteroduplex)的过程。

50. 一.概述 2.杂交 在DNA双链变性和复性过程中，两条来源不 同的单链DNA按照碱基互补配对原则形成双链 的过程。 杂交的双方称为探针和待测核酸片段。