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许冰莹, 昆明医科大学法医学院 Tel:0871-65922837； 13769175605 Email:bingying_xu@126

许冰莹, 昆明医科大学法医学院 Tel:0871-65922837； 13769175605 Email:bingying_xu@126.com. 沙皇遗骸的辨认. 1917 年，十月革命后，尼古拉二世被流放到西伯利亚的叶卡捷琳堡。 1918 年 7 月 17 日清晨全家被枪杀（至少 9 人）。 80 年代后，俄罗斯总统叶利钦亲自参加了在圣彼得堡举行的安葬仪式。. 第七章 线粒体 DNA 多态性 mitochondrial DNA of polymorphisms. 第一节 概述 第二节 mtDNA 多态性 第三节 mtDNA 分型命名 第四节 mtDNA 分型技术

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许冰莹, 昆明医科大学法医学院 Tel:0871-65922837； 13769175605 Email:bingying_xu@126

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  1. 许冰莹,昆明医科大学法医学院Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_xu@126.com许冰莹,昆明医科大学法医学院Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_xu@126.com

  2. 沙皇遗骸的辨认 • 1917年，十月革命后，尼古拉二世被流放到西伯利亚的叶卡捷琳堡。 • 1918年7月17日清晨全家被枪杀（至少9人）。 • 80年代后，俄罗斯总统叶利钦亲自参加了在圣彼得堡举行的安葬仪式。

  3. 第七章 线粒体DNA多态性mitochondrial DNA of polymorphisms 第一节 概述 第二节mtDNA多态性 第三节mtDNA分型命名 第四节mtDNA分型技术 第五节mtDNA分型的特殊问题

  4. 教学内容和要求 掌握：mtDNA多态性、 mtDNA分型技术 了解：mtDNA分型命名 mtDNA分型的特殊问题

  5. 第一节 概述(summary) 1.线粒体（mitochondrion）: 细胞器，氧化磷酸化和提供能量的场所。 2.线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）: 细胞核外DNA，编码蛋白质和RNA的基因， 人体不同组织细胞所含有的线粒体数目及DNA 拷贝数不同，在数百至数万之间变化。

  6. 生物的遗传 主要在核染色体上 细胞质内 细胞核遗传 细胞质遗传 DNA分布 （核染色体是DNA的主要 载体）97.5% 2.5%

  7. 第一节 概述 线粒体电镜照片

  8. 线粒体——“能量工厂” 线粒体是核外唯一含有遗传效应物质的细胞器。

  9. 线粒体是真核细胞内的重要细胞器，它是细胞的能量工厂，细胞产生能量的95%来自线粒体中进行的氧化磷酸化。除了红细胞外，人类所有体细胞都含有线粒体，其中多数细胞含有数以万计的线粒体。线粒体是真核细胞内的重要细胞器，它是细胞的能量工厂，细胞产生能量的95%来自线粒体中进行的氧化磷酸化。除了红细胞外，人类所有体细胞都含有线粒体，其中多数细胞含有数以万计的线粒体。

  10. 一.mtDNA的结构和功能(Structure and function of mtDNA) 1.mtDNA的结构特征(The structural characteristics of mtDNA) 线粒体是细胞质中独立的细胞器，也是动物细胞核外唯一的含有DNA的细胞器。 1981年，剑桥大学的Anderson小组测定了人mtDNA的完整DNA序列，称为“剑桥序列”。 由于缺乏组蛋白的保护，线粒体亦缺乏DNA损伤修复系统，mtDNA的突变率较高。

  11. 人mtDNA是一个长为16,569 bp的双链闭合环状分子，外环含G较多，称重链(H链)，内环含C较多，称轻链(L链)。 mtDNA双链闭合环状在降解检材中不易被核酸外切酶影响，在法医检材中能保持mtDNA完整性。

  12. 线粒体结构特征(The structural characteristics of mtDNA) 1.双链16569bp，其中一 条为重连，一条为轻连。 基因编码物各不相同。 2.基因中不含非编码序列。 3.几乎不含终止密码。 4.转录与翻译均在线粒体 中进行。 6.DNA不与组蛋白结合。 7.部分密码子不同于核基 因组密码子。

  13. 1.mtDNA的功能特点（The functional characteristics of mtDNA） （1）碱基结构紧凑、简洁：以最少碱基数编码尽量多的蛋白质和RNA；基 因间无间隔序列，基因内无内含子、前导序列、带帽序列和终止信 号； 相邻基因甚至有碱基的重叠。 （2）不存在同源基因间的重组与交换。 （3）母系遗传，mtDNA所有序列变异呈单倍型特性。 卵细胞 精细胞

  14. 遗传密码与一般的通用密码不同 密码子 核DNA mtDNA UGA 终止 色氨酸AGA, AGG 精氨酸 终止AAA 赖氨酸 天冬酰胺 AUA 异亮氨酸 蛋氨酸 甲硫酰胺 AUG AUA 起始甲硫酰胺 AUG AUG AUA AUUAUC

  15. 2.mtDNA功能： （1）储存信息--编码参与氧化磷酸化的蛋白质和RNA的 H 链：2个rRNA，14个tRNA，12个蛋白质 L 链：8个rRNA，1个蛋白质 （2）自身复制--单向复制:置换环复制或D-环(D-loop)复制 特点：不对称的复制 H链和L链各有一个复制起点，先复制H链， H链复制到达L链起始点后，L链开始复制 D-环：新合成第三条H链姊妹链 ，序列与L链互补 H链复制起点附近（ 520-700 ），高变异。 （3）转录功能--两条链同时转录合成RNA--对称转录

  16. mtDNA与核常染色体DNA的比较

  17. 二. mtDNA 1.母系遗传：直接从母亲传递给孩子。 2.高拷贝数和异质性 在一个细胞中具有数百到数万个拷贝。 当两种不同的mtDNA序列存在同一个细胞、组织或者个体时，称为异质性 3.复制分离和瓶颈效应 卵细胞有10万份mtDNA的拷贝，能够进入下一代的只有很少（1到数个）-- 瓶颈效应。 mtDNA自主复制，不依赖核染色体而将复制后的DNA分配到子细胞中去。 在一个个体内，突变mtDNA的比例可以在细胞分裂的组织中进行的mtDNA复 制而发生改变，随着时间推移，将导致表现型的变化。--复制分离

  18. 二. mtDNA 4.阈值效应 对于发生异质性的mtDNA突变，细胞可以承受正常mtDNA的减少直至达到 一定阈值，将会发生细胞死亡或细胞功能受到损坏。 5.半自主的细胞器 自身含有遗传表达系统（自主性），但编码的遗传信息十分有限，其 RNA的转录、蛋白质翻译等功能发挥必需依赖核DNA编码的遗传信息。

  19. 第二节 mtDNA多态性 主要集中在mtDNA的非编码区（D环）和部分编码区。其中D环含有两个高变区（high variable regions,HVR）I和II,无修复系统，不受选择的影响，积累了较多的变异，多态性很好，适用于法医学研究。

  20. mtDNA突变率比较高 高 变 区HVR-I 29 ～ 408号碱基 HVR-II 15996 ～ 16401号碱基 HVR-III 438 ～ 574号碱基 主要原因A : mtDNA没有组蛋白的保护 B : DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶校正功能 C : 缺乏DNA损伤的修复体系 D : mtDNA极少或不受来自选择压力的影响 突变类型碱基的错配---序列多态性 主要为转换（90%）：嘧啶转换 HV-I 80% HV-II 20% 少数是顛换（10%）： C→A 或 A→C 插入或缺失----长度多态性 poly—C：nt16184-nt16193 ( HV-I ) CA 重复：nt514-nt523 ( HV-III )

  21. 一.mtDNA多态性的类型（The polymorphism of mtDNA type） 1.点突变的多态性 DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有 酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。 2.序列多态性 ①DNA排列顺序发生改变：缺失、重复、插入所致。 ②高变区（highly variable region ）内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。

  22. Anderson剑桥序列 1981年Anderson等人完成最初的剑桥序列， 1999年再次分析序列更正了最初序列，确定了11处错误。 现在以修正序列为准。 整个线粒体基因组应是16568bp，法医学中应用的 高变区的序列涵盖了nt16024-nt16365和nt73-nt340。

  23. mtDNA在法医学上常用的位点 1.序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。 HV1：nt16024～nt16365，342bp。 HV2：nt73～nt340，268bp HV3：nt438～nt574，137bp 2.长度多态性（Length polymorphism） • nt514-nt523：CA重复 • C-stretch: polyC

  24. 16024 16365 73 340 1 HV2 HV1 Control region(D-loop) 576 16024 22 tRNAs OH 2 rRNAs 12S rRNA F T V cyt b 13 genes 16S rRNA 1/16,569 P E L1 ND6 ND5 ND1 L2 “16,569” bp I S2 Q H M OL A ND4 ND2 N C Y W ND4L 9-bp deletion S1 R ND3 COI G COIII ATP6 COII D ATP8 K Heavy (H) strand Coding Region Light (L) strand

  25. 二.mtDNA单核苷酸多态性(mtDNA single nucleotide polymorphism, mtDNA SNP) 1.概念 一个种族不同个体的基因组或共同序列之间，存在单个核苷 酸的差异。 在人群中，单核苷酸多态性一般有两个等位基因，在不同 的民族、地区中，同一个等位基因的频率有高有低。 线粒体DNA序列中有1122个碱基是非编码序列，在编码区 55个碱基不参与编码蛋白。

  26. 二.mtDNA单核苷酸多态性(mtDNA single nucleotide polymorphism, mtDNA SNP) 2.序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。 HV1：nt16024～nt16365，342bp。 HV2：nt73～nt340，268bp HV3：nt438～nt574，137bp

  27. 三.mtDNA串联重复序列多态性( mtDNA short tandem repeats,STR) 集中在D-loop区,核心序列一般在10bp以下，常见的是CA重 复（nt514-nt523）和 polyC （nt568-nt573和nt303-nt309）.

  28. 三.mtDNA串联重复序列多态性( mtDNA short tandem repeats,STR) 由于有多态性重复序列的存在，实际人类 mtDNA的长度不总是16569bp,可能会有10bp左 右的增减。

  29. 四.mtDNA单倍群（mtDNA haplogroup） 线粒体单倍群或单倍型类群是一组类似的单倍型（haplotype），它们有一个共同的单核苷酸多态性祖先。单倍群由相似的单倍型组成，可以从单倍型来预测单倍群。而单核苷酸多态性分析被用来确认单倍型。单倍群以字母来标记，并且以数字和一些字母来补充。 单倍群用来揭示数千年前的祖先来源。 追溯母系遗传的人类起源。

  30. 第四节 mtDNA多态性分析技术 序列多态性（Sequence polymorphism） 主要集中在D-loop区。--HVRI,HVRII,1122个碱基 HV1：nt16024～nt16365，342bp。 HV2：nt73～nt340，268bp 长度多态性（Length polymorphism） • nt514-nt523：CA重复 • C-stretch: polyC

  31. 第四节 mtDNA多态性分析技术 • 长度多态性：AMP-FLP分析技术 • 序列多态性： • PCR-RFLP法 • PCR-SSO杂交法 • PCR—DNA自动测序 目前分析mtDNA多态性最常用，也是最准确的方法。

  32. 四.mtDNA的PCR-RFLP分型 形成mtDNA序列多态性主要是点突变，在HV-I和HV-II区段，具有变异的碱基位置有700～800个，其中大约有2/3的碱基变异涉及到限制酶识别点回文式序列的改变，构成典型的RFLP现象。

  33. 四.mtDNA的PCR-RFLP分型 在mtDNA 控制区D环，有88个突变点，其中 只有21个能采用PCR-RFLP分析进行分型。 检测mtDNA上多个多态性位点的序列，可以 形成多个单倍型（haplogroups）组合，个人 识别力比单个位点的明显提高。

  34. 五.法医学应用（Forensic application） • PCR-RFLP 技术的优点 1.分型技术简单，结果判定容易。 2.电泳后不需测定片段长度，避免了测量误差，可以准确判定基因型。 3.分型结果稳定，重复性好，分析结果可以用数字化的形式记录保存。 4.特异性好，灵敏度高，对检材质量要求低。

  35. 一.法医mtDNA分型（Forensic mtDNA typing） 什么时候需要做mtDNA分析？ 当细胞核DNA量不足无法进行核DNA分型 时， mtDNA分析技术是唯一可以利用的技术。 人体生物检材中的毛发、骨头、牙齿以及其它 严重降解的生物检材均可进行mtDNA分析。

  36. 二.PCR循环测序-mtDNA序列多态性流程 1.样本mtDNA模板的制备 2.PCR扩增HV1和HV2区域 3.正、反向引物对HV1和HV2区域进行序列测定 4.对比正反向序列确定mtDNA序列 5.与Anderson序列对比找出不同碱基 6.确定该样本mtDNA 的单体型

  37. 1.样本mtDNA提取 生物样本： 缺乏毛囊的毛干 暴露在空气的陈旧的骨骼、牙齿 核DNA检测失败的血痕、拭子、组织 严重降解的生物检材

  38. 2.人类线粒体基因组DNA高变区分析 分析ＨＶＲⅠ和ＨＶＲⅡ。 1.第一次扩增　用L15926-H00580引物扩增D环区片段（1.3kb)。 2.第二次扩增　用L15997-H16401引物和L00029-H00408引物分别扩增HVRⅠ和HVRⅡ片段。 3.测序模板扩增 双链DNA测序经过L链和H链分别从两个方向测序，对比两链相应碱基的互补性，可以获得准确的序列。 4.测序 用自动荧光检测完成。

  39. 清洗毛干 溶解细胞 提取毛干中的DNA的步骤 保护DNA分子，防止酶切 纯化DNA 存储DNA

  40. 二氧化硅悬浮液的制备 除菌，防止外源性DNA的污染 骨粉的制备

  41. 除去杂物，纯化DNA 骨细胞脱钙 从gui珠洗脱DNA 原理：对骨骼进行清洗、消毒、磨为粉末，然后对骨细胞进行裂解，采用吸附和超滤作用对DNA提取和纯化。

  42. 3.人类线粒体基因组STR位点分析 位于D环中nt514-523位点处有CA重复。 扩增片段长度多态性分析技术检测。

  43. 法医学实践中如何根据mtDNA序列多态性进行个体识别或亲子鉴定？法医学实践中如何根据mtDNA序列多态性进行个体识别或亲子鉴定？

  44. 第五节 mtDNA分析在法医学上的应用 • 优势 • 局限性 • 结果解释

  45. 一.mtDNA的特点及其法医学应用优势 1.唯一的核外DNA来源 可检测样品范围增大，为很少或没有nDNA（nucleic DNA）的 样本的检验提供了希望。如骨骼、指甲、毛干等。 2.拷贝数多 适于微量、高度降解样本。 3.母系遗传 可选择的比对参照样本范围扩大。 • 如遗骸的个人认定或一个失踪的人无法提供参考样本，可用其母亲、兄弟姐妹等血液作为参考样本。

  46. 二.mtDNA序列分析用于下列情况 • 脱落毛发 • 指甲、骨骼、牙齿 • 极微量血痕 • 核DNA分型失败样本

  47. 案例1 Holland等（1993年）对1984年越南归还的越战身亡美国士兵的残骸成功地进行了身源鉴定。这些残骸遗存于自然环境下长达24年之久。 • 案例2 沙皇遗骸的辨认（1918年埋葬，1991年挖掘，1994年测定mtDNA序列） • 案例3 （1996年美国）现场仅从死者身上发现1根毛发。mtDNA序列分析与犯罪嫌疑人 Paul Ware 的完全匹配，Paul Ware 被判强奸、谋杀罪。这是mtDNA序列分析首次在法庭上作为证据。

  48. Louise of Hesse-Cassel 16169T/C 16169T/C Georgij Romanov Tsar Nicholas II Tsarina Alexandra SOURCES: Gill et al. (1994) Nature Genetics, 6, 130‑135.; Ivanov et al. (1996) Nature Genetics, 12, 417‑420; Stone, R. (2004) Science, 303, 753. Prince Philip Duke of Edinburgh Mitotype 16111T 16357C 263G 315.1C Xenia Cheremeteff-Sfiri Mitotype 16126C 16169T 16294T 16296T 73G 263G 315.1C Identifying the Romanov Remains(the Last Russian Czar)

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