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第十三章 基因的化學組成與特性

第十三章 基因的化學組成與特性 . 大綱 DNA 的發現與組成 DNA 的化學結構 DNA 的變性 (Denaturation) DNA 的復性 (Renaturation) DNA 的重複性 (Repetitive DNA) 衛星 DNA (satellite DNA) 不同生物基因組大小 . DNA 的發現與組成 Griffith 的實驗 1928 年， F. Griffith 發現肺炎雙球菌 (Streptococcus pneumoniae) 內含一種轉形物質，它 具有使細胞產生轉化的能力 Griffith 用兩種肺炎雙球菌 :

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第十三章 基因的化學組成與特性

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  1. 第十三章 基因的化學組成與特性 • 大綱 • DNA的發現與組成 • DNA的化學結構 • DNA的變性(Denaturation) • DNA的復性(Renaturation) • DNA的重複性(Repetitive DNA) • 衛星DNA (satellite DNA) • 不同生物基因組大小

  2. DNA的發現與組成 • Griffith的實驗 • 1928年， F. Griffith發現肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)內含一種轉形物質，它 具有使細胞產生轉化的能力 • Griffith用兩種肺炎雙球菌: • 光滑型細胞(S strain):外表光滑，細胞表面有多糖層，是一種膠囊層，保護在外，這種細 胞具有致病性 • 粗糙型細胞(R strain) :外表粗糙，細胞表面缺乏多糖層保護，此種細胞無致病性。

  3. 方注與結果 • 活的S細胞注射入老鼠→老鼠死 • 活的R細胞注射入老鼠→老鼠活 • 以熱殺死的S細胞注射入老鼠→老鼠活 • 以熱殺死的S細胞與活的R混合注射老鼠→老鼠死， 並且從死老鼠體內可分離出活的S，此活的S又具有致病力 • 推論:死的S細菌內會轉形物質，它能使活的R轉形成活的S，且該S叉具有致病力。

  4. Avery等人的實驗：1944年， O. A very， C. MacLeod， M. McCarty 希望找出轉形物質? • 分析S細胞發現含:蛋白質(protein)、多糖(polysaccharide)、DNA 、RNA • 為了找出是那一種物質具有轉化能力，做了以下的實驗: • Avery等人推論出: DNA就是轉化物質，它具有轉化的能力 結果 只有R細胞出現 只有R細胞出現 會有S細胞出現 只有R細胞出現

  5. 1952年A. D. Hershey & M. Chase的實驗証明DNA就是遺傳物質 • 材料: 大腸菌(E. coli) • 兩種噬菌體T2: 一種以S35標誌蛋自質， 一種以p32標誌DNA • 用放射線標誌的目的是要追蹤DNA或蛋白質的行蹤 • 方法 • 帶S35的噬菌體T2感染大腸菌十分鐘 以攪拌器攪拌，除去附著在大腸菌的噬菌體，離心結果分成上層液與沉澱物，結果放射性出現在:上層液 • 帶p32噬菌體T2感染大腸菌，重複以上實驗，結果放射性出現在:沉澱物 • Hershey & Chase的實驗結果推論出 • 噬菌體感染細胞，是 DNA進入細胞。 此實驗証明: DNA就是遺傳物質。 • 有些病毒是以RNA為遺傳物質，例如煙草鑲嵌病毒 ，反轉錄病毒(retrovirus)0

  6. DNA的組成 遺傳物質：核酸(nucleic acid) 核酸：DNA（去氧核醣核酸）、RNA（核醣核酸） 核酸基本單位：核苷酸(nucleotide) 核苷酸：鹼基(base)、五碳醣(pentose sugar)、磷酸(phosphate)

  7. 鹼基的結構 A-Adenosine 腺嘌呤 T-Thymine 胸腺嘧啶 G- Guanine 鳥糞嘌呤 U-Uracil 尿嘧啶 （RNA） C-Cytosine  胞嘧啶

  8. DNA的結構一 三個氫鍵 二個氫鍵

  9. DNA的結構二

  10. 2-2 DNA雙股螺旋的構造 James D. Watson (left) and Francis Crick propose a double- helical structure for DNA. (1953) 1962 諾貝爾生醫獎 影片 Francis Crick Frederick Wilkins James D. Watson

  11. 書名：DNA光環背後的奇女子 作者：馬杜克斯（Brenda Maddox）譯者：楊玉齡出版時間：2004年12月出版公司：天下文化 羅莎琳．法蘭克林（Rosalind Franklin, 1920~1958） 讓黑暗女郎回歸榮耀

  12. DNA X-光繞射圖

  13. DNA的變性( Denaturation) • 定義：雙股DNA變成單股稱為變性 • 使DNA變性的方法 • 加熱：熔解溫度(Tm， Melting temperature) 雙股DNA經加熱分解成單股，當有50%雙股DNA分開成單股時的溫度稱為熔解溫度 • 溫度繼續提高DNA打開成單股愈多，吸光度愈增加，但當 全部DNA均打開成單股，吸光度不再增加 • DNA分子G+C組成與Tm的關係 • G+C含量愈多Tm愈高，二者是呈直線關係。 因：GC間氫鍵較多，需要較高的能量才能使DNA變單股 • 在高鹽溶液中Tm增高。DNA在高鹽溶液中，構造愈穩定， Tm愈高。

  14. 甲醛( formaldehyde) DNA放在4%甲醛中，甲醛會與DNA鹼基的氨基(amino group)結合，使DNA變性 • 原因：DNA分子會呼吸，可謂是一種動態的結 構，DNA鹼基間的氫鍵會自動斷裂又重新形成，當DNA氫鍵斷裂，鹼基露出來可與甲醛結合，DNA 變成單股不能再變回雙股 • 鹼性溶液：當pH> 11.3，DNA分子內所有的氫鍵都會斷裂 • 螺旋不穩定蛋： • 噬菌體T4基因32產生的蛋白稱為helix-destabilizing protein或稱熔解蛋白或稱單股結合蛋白 • 會與單股DNA的鹼基結合 • 此蛋白質喜好緊集排列在單股DNA上

  15. 將DNA與螺旋不穩定蛋白放在一起，經一段時間之後，會發 現某些部份的DNA打開成單股，其上有很多此種蛋白結合在 上面 • 此結果顯示: DNA分子會呼吸，氫鍵自動斷裂又自動形成， 當DNA因呼吸打開時，只要有第一個螺旋不穩定蛋白與其上 的base結合，就會招引更多的蛋白與鄰近的base結合。於是大家都過來擠，最後DNA完全變性成單股。以這種方式使 DNA變性，通常是發生在DNA複製時

  16. DNA的復性(Renaturation) • 定義：單股DNA變回雙股稱為renatruation • 決定DNA renaturation的因子 • 高鹽(high salt) : 高鹽下可減低磷酸根間的排斥力 一般NaCl濃度是在0.15M-0.5M。 • 溫度: Renaturation最適溫度是比Tm 低 20-25 ℃ • 溫度太高會使各股間的base不會配對 • 溫度太低會產生股內的的氫鍵 • DNA濃度: 濃度愈高，愈容易發生renature • DNA複雜性( DAN complexity) • 與重複性有關， • DNA分子內若含某一段DNA 重複多次出現DNA複雜性就低，無重複性的DNA分子， 複雜性愈高 • DNA重複性愈高，即complexity愈低，愈容易發生renature

  17. DNA-DNA雜合(hybridization) • DNA renaturation的基本條件:只要互補的兩段DNA即可 形成雙股，不一定是要與原來互補的那一股配對 • 不同來源 的DNA例如不同菌種的DNA放在一起，經denature再 renature‘如果二者之間有相同的一段，只要能配對，不同菌種 的DNA也可形成雙股 • 這樣的DNA稱為雜合的DNA：指不同來源的DNA形成雙股DNA • 如何測單股DNA發生復性? • 紫外光吸光度(UV absorption) DNA由單股變雙股的結果，對260nm的吸光度會降低

  18. CsCI密度梯度(density gradient) • 將DNA放在CsCl溶液中，經超高速離心，DNA會停留在與其密度相同的位置 • 當DNA由單股變雙股，密度會降低，因為兩股間有氫鍵形成 • 濾紙結合測試法(Filter-binding assay) • 硝酸纖維濾紙，只與單股DNA結合， 不與雙股DNA或RNA結合。 DNA由單股變雙股後，通過濾紙時，不會與濾紙結合，而會穿過濾紙 • DNA會吸光的原因? 鹼基具有環狀構造會吸光

  19. DNA變性，復性的應用價值 • 可測試生物在演化上的相關性。 例:測試大腸菌與沙門氏菌DNA是否有相同的鹼基序列 • CsCI密度梯度離心 • 大腸菌N14 DNA與沙門氏菌N15 DNA加核酸酶，加熱使兩種DNA都分成單股，兩種DNA混合，使其復性成雙股，放入CsCI密度梯度離心 • 結果: 有雙股N15-N15 ， N14-N14， N14-N15，其中N14-N15雜合雙股的存在，表示兩種生物間有一段DNA能互補產生雜合 • 濾紙結合試驗 • 將過量的單股大腸菌DNA放在濾紙上，加碳14 標誌小段的沙門氏菌DNA，若沙門氏菌DNA與大腸菌DNA有互補的序列，會結合在濾紙上，洗去多餘的沙門氏菌DNA，測 濾紙的放射性 • 若有，表示大腸菌DNA與沙門氏菌DNA發生雜合

  20. 依生物間DNA雜合的情形，可知演化上同源性的程度依生物間DNA雜合的情形，可知演化上同源性的程度 • 大腸菌DNA與沙門氏菌DNA 有相同的序列，顯示在演化上，它們是有相關性存在 • 人類與 其它靈長類也可由此方法研究他們在演化上的相關性 • 此方法可做DNA-RNA hybridization • 以帶有放射性的單 股RNA取代前面所用的放射性DNA，若有DNA-RNA雜合現象，表示DNA中含有製造該段RNA的 基因

  21. DNA的重複性 • 真核DNA依其重複性分為 • 獨特不重複序列(unique sequence， single copy sequence) 此種序列在genome內只出現一次 • 原核與病毒的基因組幾乎全部是 • 真核的佔基因組 的30-70% • 中度重複(middle repetitive sequence) :重複次數達106 • 高度重複(highly repetitive sequence) :一段5-300bp的序 列，重複次數達106或以上 • 原核genome: 0%為重複序列，主要為不重複序列 • 低等真核genome: 20%為中度重複序列，其餘為不重複序列 • 動物genome: 50%以上為中度與高度重複序列 • 植物及兩棲類genome: 80%以上為中度與高度重複序列

  22. 人類基因組中的重複DNA (repetitive DNA) • 基因組中20一30%為repetitive DNA 分兩種 • 前後排列重複序列(tandemly repeated sequences) 數個基因重複前後排列在一起，例如多基因家族(multigene families)、迷你衛星(minisatellites) • 分散因子(interspersed elements) 單一一段序列重複出現，但分散在整個基因組中，例如Alu序 列。

  23. 衛星DNA (Satellite DNA) • 定義：真核染色體上某部位DNA，其鹼基組成與其它部位的DNA不同， G＋C含量可能特別高，或特別低 • 由Cot分析，發現satelliteDNA 多為高度重複，同一段序列可能重複達106之多 • satellite DNA為前後重複( tandem repeat) • satellite DNA不會轉錄也不轉譯 • 衛星DNA只出現在真核 • 將大腸菌、螃蟹、果蠅DNA抽出之後經CsCl梯度密度離心大腸菌會產生一個主峰，螃蟹會產生兩個峰，果蠅有4個峰 • 螃蟹: 70%的DNA生成主峰，此種DNA中有42%為G+C，30%的DNA生成次峰，此種DNA中有3%為G+C。 次峰內的DNA即稱為satellite DNA，satellite DNA所含的G＋C可能比主峰的DNA高或低。

  24. Satellite DNA究竟位在染色体的什麼部位? • 利用原位雜化(in situ hybridization) ，先將細胞固定在切片上加 鹼性溶液，使DNA變性，再加H3標誌單股satellite DNA (或標誌的RNA) • 使其產生復性(renaturation)。洗去多餘的H3 labeled satellite DNA‘，蓋上X光底片，經自動顯影技術，底片曝光結果，可以看到衛星DNA多存在異染色質 (heterochromatin)，即是在中心節附近或染色体的端點

  25. 人 類 基 因 體 計 劃 Human Genome Project (HGP) 約翰 薩爾斯頓 John E. Sulston

  26. 國際人類基因組團隊(International Human Genome Consortium) • 美國國家衛生研究院 NIH ( National Institute of Health) • 美國國家能源部 • 英國Sanger中心 (衛康信託基金會贊助) • 德國 法國 日本 中國………等十五個國家 超過六十個各別的大學和研究機構，分工進行定序工作 • 負責總單位美國國家人類基因研究院 (National Human Genome Research Institute)

  27. 塞雷拉版 國際人類基因組團隊版 DNA資訊來源 基因藍圖由公立Gene 基因藍圖由公立Gene Bank和獨立資料庫同組成 Bank單一來源築構 基因組樣本 5位不同性別種族人體 數名匿名捐贈者 定序鹼基長度 99%連續 90%(43%不連續) 定序基因數目 26,383完成 23,147 主要定序方法 散彈定序法 傳統 physical mapping +大片段逐步定序 定位的SNPs 約兩百一十萬 約一百四十萬 數量 耗時 9個月 14+年 計劃主持人 Craig Venter Ph.D Francis Collins Ph.D 2000年所公布的人類基因組草圖

  28. BAC 100-300 kb (bacterial artificial chromosome) YAC 1000 kb (yeast artificial chromosome) Cosmid 45 kb Phage 20-30 kb

  29. Contig 連續性序列 • Scaffold 由多個contig所連接成的大片段DNA架構 • Genetic Map 遺傳圖譜 • Physical Map (物理)實質圖譜 • Draft sequence 序列草圖-有片段不完整，順序、方向可能有些錯誤 • EST (Expressed Sequence Tag) 會表現的基因中所選出的小片段， 可作為定位標記 • 人類基因組於2003年4月15日宣佈：Finished Sequence 每(10萬)個核苷酸錯誤少於一個，排列位置或方向均正確，幾乎沒有缺口 • STS (sequence Tagged Site) 當做定位或序列組合時的標記

  30. Human Genome Project Goals and Completion Dates Area Goal Achieved Date AchievedGenetic Map 2- to 5-cM 1-cM (600 – 1,500 markers) (3,000 markers) September 1994Physical Map 30,000 STSs 52,000 STSs October 1998DNA Sequence 95% gene-containing part 99% finished to 99.99% accuracyof April 2003Cost 500 Mb/year at >1,400 Mb < $0.25 base <$0.09 base November 2002Variation 100,000 SNPs 3.7 million SNPs February 2003Gene Full-length cDNAs 15,000 cDNAs March 2003

  31. 單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)生物基因體內某一位置的單一核苷酸不同個體間並不一樣 • 個體差異0.1%，大約300萬鹼基 • 重要性 • 增加生存機會(面對環境變遷)體質差異? • 多基因疾病與藥物反應的指標 • 1.1%的基因組為製造人體"零件"的表現序列(exons) • 24%為不表達蛋白質的序列(introns) • 75%的基因序列不是沒有實際作用就是功能未知 • How Many Genes Are in the Human Genome?

  32. Copy number variation (CNV) of DNA sequences is functionally significant but has yet to be fully ascertained. We have constructed a first-generation CNV map of the human genome through the study of 270 individuals from four populations with ancestry in Europe, Africa or Asia (the HapMap collection). DNA from these individuals was screened for CNVusing two complementary technologies: single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping arrays, and clone-based omparative genomic hybridization. A total of 1,447 copy number variable regions (CNVRs), which can encompass overlapping or adjacent gains or losses, covering 360 megabases (12% of the genome) were identified in these populations. These CNVRs contained hundreds of genes, disease loci, functional elements and segmental duplications. Notably, the CNVRs encompassed more nucleotide content per genome than SNPs, underscoring the importance of CNV in genetic diversity and evolution. The data obtained delineate linkage disequilibrium patterns for many CNVs, and reveal marked variation in copy number among populations. We also demonstrate the utility of this resource for genetic disease studies

  33. 1995 嗜血桿菌 1.83 Mb, 1740 基因 黴漿菌 0.58 Mb, 517 基因 1996 酵母菌 12 Mb, 6000 基因 古生菌 1.7 Mb, 1738 基因 1997 大腸桿菌 4.6 Mb, 4289 基因 2001 線蟲 97 Mb, 20262基因(草圖 1998) 2002 河豚 365 Mb, 30000基因 小鼠 2500 Mb, 25000基因(草圖 2002) 2003 水稻 430 Mb, 50000基因 2003 果蠅 128 Mb, 13600基因(草圖 2000) 2003 人類 3300 Mb, (草圖 2000)

  34. 阿米巴原蟲類 Amoeba dubia 670,000 Mb 阿米巴原蟲類 Amoeba proteus 270,000 狹葉瓶爾小草Ophioglossum petiolatum 160,000 非洲肺魚 Protopterus aethiopicus 139,000 川貝母 Fritillaria assyriaca 124,900 鐵炮百合 Lilium longiflorum 90,000 雙指兩棲螈 Amphiuma means 84,000 泥蠑 Necturus maculosus 81,300 蘚苔松類 Pinus resinosa 68,000 台灣百合 Lilium formosanum 36,000 圓篩藻屬Coscinodiscus 25,000 蠑螈 Triturus cristatus 20,600 洋蔥 Allium cepa 18,000 沙漠蝗蟲 Schistocerca gregaria 9,300

  35. 草履蟲 Paramecium caudatum 8600 盤古蟾蜍 Bufo bufo 6900 貓鯊屬 Scyliorhinus [ 軟骨魚綱] 6000 土豚 Orycteropus afer 5763 鼠類 Peromyscus eremiticus 5295 原猴科Tarsius syrichta 5152 猴科Cercopithecus cephus 5142 猴科Cercopithecus nigroviridis 5117 玉米Zea mays 5000 大麥Hordeum vulgare 5000 鼠類Thomomys townsendii 4934 http://www.cbs.dtu.dk/databases/DOGS/index.php

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