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Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”

Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”. Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte !. Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912) Polio 100 % (USA, Westeuropa)

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Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”

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Presentation Transcript

  1. Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”

  2. Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte ! Vor und nach Einführung des Impfstoffes(CDC seit 1912) Polio 100 % (USA, Westeuropa) Pocken 100 % (weltweit) Masern/Mumps/Röteln 99 % (USA) Diphtherie 99 % (USA, Westeuropa) Keuchhusten 97 % (USA) Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999) Neisseria meningitidis C 92 % (Kleinkinder) 95 % (Heranwachsende) Salmonella Vi Konjugat 90 % (2 - 4 jährige Kinder) Sicherheit ? Masern-Enzephalopathie 1/1000 natürliche Infektion 1/1.000.000 Impfung

  3. Die drei größten Killer in Millionen (Jahr 2000) 2.3 AIDS 1,7 TB 0.5 TB/HIV 1.2 Malaria

  4. Dringend benötigte Impfstoffe: HIV Tuberkulose Malaria Hepatitis C Chlamydien Helicobacter pylori Leishmaniose Filariose Schistosomiasis (Bilharziose) Papilloma Virus Rotaviren (Durchfallerkrankungen) Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren u.v.a. Nicht nur Infektionskrankheiten Tumorvakzine Alzheimer

  5. Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung ► Memory/Immuologisches Gedächtnis ► Wirksamkeit von Vakzinen Nachweis von Immunantworten ► Neue Strategien zur Verbesserung alter und zur Entwicklung neuer Vakzine !

  6. Memory/Immunologisches Gedächtnis ► B-Zell-Memory - Antikörper - Memory-B-Zellen - Plasmazellen ► T-Zell-Memory - CD4 Th-Zellen - CD8 T-Zellen

  7. B-Zellen/Antikörper ► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der Induktion von B-Zellen/Antikörpern ► Antikörper sind relativ leicht induzierbar ► Die Induktion und Wirksamkeit von Antikörpern lässt sich relativ einfach testen. -> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine

  8. B-Zell-Memory/Antikörper: Nachweis einer B-Lymphozytenantwort ►Qualitativer und quantitativer Nachweis von spezifischen Antikörpern • ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) • Western-Blot • Neutralisierungstests ►Nachweis der antikörperbildenden Zellen • Plaquetest • ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)

  9. Memory-T-Zellen Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen ► CD4, CD8 ► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil) - Th1, Th2, Th17…. ► Memory-T-Zellsubpopulationen - central Memory T-Zellen - effector Memory T-Zellen ► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren ► Lokalisation der T-Zellen - Lunge, Darm…. Welche dieser Populationen schützt ??

  10. Central vs Effector-Memory T-Zellen CD4 CD4 CD8 Sallusto et al, Science 1999

  11. Central vs Effector-Memory T-Zellen Central Effector CCR7 ++ - CD62L ++ +/- Gewebe Lymphgewebe Peripherie Proliferation ++ +/- Effektorfunktion +/- ++ Cosignale ? - Lebensdauer + ?

  12. Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort Problem: Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares und einfach messbares Zellprodukt vorhanden!

  13. Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen (z.T. semi-quantitativ) in vitro • Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit dem Antigen • Zytotoxizität • Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay) • T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone in vivo • DTH Reaktion (Tuberkulin-Test) • Bestimmung der schützenden Immunität “Infektionsexperimente“

  14. Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse der T-Lymphozyten-Antwort • ELISPOT-Assay • Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer Antigenstimulation • MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere)

  15. Klassisches Beispiel einer Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction: Tuberkulin-Test

  16. Zytokintest

  17. Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) 100 naiv 80 immunisiert mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm 60 40 20 0 0 20 60 80 40 Tag nach einer Infektion mit S. typhimurium (400 i.v.)

  18. Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) -> Große Impfstudien können auch als Infektionsexperiment angesehen werden

  19. T T * * * * * * * * APC APC APC APC * * * * * * * * T T * * * * * * * * T T E E E E Entfernen der Zellen ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Methode: anti-IFNg-Antikörper + T-Zellen + APC +Antigen 24h E E E E Substrat anti-IFNg-Antikörper -Enzymkomplex

  20. ELISPOT-Assay Beispiel 250 ohne Antigen 200 150 IFN-g+ Spots/105 Zellen 100 50 mit Antigen 0 - - Antigen Antigen infiziert naiv

  21. FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung Prinzip: Blockade der Zytokinsekretion (Brefeldin A) Fixierung und Permeabilisierung der Zellen intrazelluläre Zytokinfärbung mit Antikörpern

  22. CD8 g IFN - Intrazelluläre Zytokinfärbung Beispiel: FACS Inkubation CD8 T T T T extra- und intrazelluläre Färbung APZ APZ APZ APZ g IFN - T T T T APZ APZ APZ APZ 4h

  23. Multizytokin-Produzenten

  24. PE PE PE PE PE PE Streptavidin Streptavidin MHC Klasse I-Tetramere Prinzip H-2Kd Peptid (LLO91-99) b2-Mikroglobulin Biotin CD8 TZR

  25. L. monocytogenes-Infektionsmodell Primärinfektion (103 i.v.) Titer Sekundärinfektion (105 i.v.) 1 0 2 Wochen

  26. Tag 0 Tag 3 Tag 5 Tag 7 9,44 0,36 1,48 20,05 L. monocytogenes-Infektionsmodell Primärinfektion Tag 0 Tag 4 Tag 7 Tag 10 Tag 17 0,02 0,14 2,22 3,11 1,41 Tetramer PE Sekundärinfektion CD62L FITC Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99

  27. HIV-Infektion anti-viral Therapy 107 3 106 2 105 HLA-B27-gag 263-272 staining (%) Viral load (copies per ml) 104 1 103 102 0 0 100 200 300 400 Days after HIV infection McMichael and Rowland-Jones, Nature 2001 410:908

  28. Akute Infektiöse Mononukleose (Epstein-Barr-Virus) Callan et al. JEM 1998 187:1395

  29. Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung: • Biologie der Immunantwort: • Welche Immunantwort schützt? • (Welche führt zu Pathologie?) • Tiermodelle zur Testung • Korrelat für Schutz im Menschen. • Biologie des Erregers: • Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle? • Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung) • Impfstoff-Kandidatenauswahl. • - Genome, Proteome. • - Welche Antigene macht der Erreger im Wirt?

  30. Hauptproblem: Wie sieht eine schützende Immunantwort überhaupt aus? “Correlates of protection“

  31. Correlates of protection Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine schützende Immunantwort aussieht! ► B-Zellen und/oder T-Zellen? ► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen? ► Quantität der Memory-T-Zellen? ► Qualität der Memory-T-Zellen? - Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten) - Oberflächenmoleküle - Langlebigkeit - Effektorfunktionen/Proliferation

  32. Neue Strategien: 1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine - Peptide, Peptide-Agglomerate 2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren 3. Lebend rekombinant: - Antigene (Eigen-, Fremd-) - Zytokine (IL-12, GM-CSF) - Zytolysine (Listeriolysin) 4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive 5. Neue Adjuvantien 6. Prime-Boost-Ansätze

  33. Subunit-Vakzine +- rekombinante Proteine sicher, definiert, stabilwenig immunogen richtige Konformationkeine CD8 T-Zellen (B-Zellen) -> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate Peptide sicher, definiert, stabilwenig immunogen billig keine CD8 T-Zellen Konformation (B-Zellen) MHC (Impflöcher) -> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate, Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen für Proteasomen

  34. Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine - + Lebend/ ähnlich der Infektion,Entzündung attenuiert immunogen, Gedächtnis,Sicherheit mukosale Immunität,Immunsuppression Persistenz,Reversion multivalent Rekombination immunstimulatorisch lange Erfahrung (Vaccinia, Adenoviren, BCG, Salmonellen) -> Expression rekombinanter Fremdantigene, Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung

  35. Nackte DNA Vakzine - + Nackte Persistenz, ähnlichSicherheit ? DNA der Infektion,Einbau billig, haltbar CD4, CD8 T-Zellen, B-Zellen Zytokingene CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort

  36. Adjuvantien - + Adjuvantien Depoteffekt Entzündung alle Prozessierungswege Immunstimulation Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere Öl in Wasser, Liposomen Virus-like Particles Lipid A Cholera-Toxoid (B-Untereinheit)

  37. Prime-Boost-Vakzinierung McShane et al. Nat. Med. 2004 10:1240

  38. Prime-Boost-Vakzinierung TB reactive T-Zellen

  39. Tuberkulose Ist eine Impfung möglich?

  40. Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen Mykobakterien T-Zellen schützen gegen Tuberkulose-Erreger

  41. 1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG) attenuierte M. bovis-Stamm Léon Charles Albert Calmette (1.7.1863 - 29.10.1933) Jean-Marie Camille Guérin (22.12.1872 - 9.6.1961) # wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff # zunehmender Wirkungsverlust!!

  42. Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle: Listeriolysin Listeria monocytogenes O min 20 min

  43. Schutz durch einen gentechnisch veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus. ungeimpft BCG BCG ureC Hly Grode et al. JCI 2005

  44. Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag in Rhesusaffen

  45. CD4 Zellen viral load

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