Mikrobiológia a imunológia letný semester 1

1. Mikrobiológia a imunológialetný semester 1 • Mikrobiológia (všeobecná a špeciálna) - bakteriológia - virológia (vírusy + prióny) - mykológia - parazitológia *helmitológia, *entomológia, *protozoológia • Imunológia - všeobecná, - špeciálna, - sérológia, - alergológia, - autoimunológia, - nádorová, • - transplantačná,

2. Predmet štúdia medicínsky významné mikroorganizmy • tvar - morfológia, • stavba - cytológia, • životné prejavy - fyziológia a genetika, • schopnosť vyvolať ochorenie - patogenita a virulencia, • mechanizmy vyvolania ochorenia - patogenéza, • odpoveď makroorganizmu - imunológia, • poškodenie organizmu v snahe zabrániť infekcii - imunopatológia (autoimunita, alergológia) • možnosti obrany - antibiotiká, dekontaminácia, imunizácia • laboratórny dôkaz

3. Terminológia • Latinské pomenovanie • Binominálna nomenklatúra - kurzíva dvojslovné pomenovanie rod a druh, genus a species • Rod - veľkým písmenom alebo skratka Staphylococcus (S.), Escherichia (E.) • Druh - malým písmenom aureus, coli • prepis do slovenčiny - všoebecné - stafylokoky, bacily, klostrídiá….

4. Bunky • Bunky prokaryotické - archebaktérie - extrémne podmienky - eubaktérie - väčšina medicínsky významných • Bunky eukaryotické - ríša rastlinná - ríša živočíšna - hmyz, červy - ríša húb - pliesne, huby - protista - prvoky

5. Prokaryotická - bakteriálna bunka • Štruktúra: • Obal - plazmatická membrána - bunková steny • Cytoplazma - jadrová hmota, ribozómy, vakuoly, inklúzie • Vonkajšie štruktúry - púzdro, S vrstva, bičíky, fimbrie, pilli

6. Plazmatická membrána cytoplazmatická membrány, bunková membrána • Fosfolipidová dvojvrstva s proteínmi - vo vode rozpustné súčasti sú okrajové - vo vode nerozpustné - mastné kyseliny sú vnútorné • Selektívna permeabilita - určuje smer a zloženie prepúšťaných štruktúr mechanizmom - difúzie - osmózy - prenosom transportnými proteinami

7. Funkcie cytoplazmatckej membrány • selektívna permeabilita • produkcia energie (sídlo transportného systému a enzýmov) • syntéza peptidoglykanu • spoluúčasť na delení bunky • sekrécia bakteriálnych produktov • odstraňovanie splodín • sporulácia

8. Bunková stena baktérií • Základná stavebná jednotka - peptidoglykan (murein) - spleť monomérov N acetyl murámovej kyseliny a N acetylglukosaminu viazaných glykosidickou väzvou • syntéza v cytoplazme, prechod cez plazmatickú membránu, inkorporácia do pôvodnej bunkovej steny v mieste, kde ju prerušili enzýmy, opakované spojenie transpeptidázami (= cieľové miesto PNC: penicilin binding protein PBP - nedôjde k uzavretiu - osmotická lýza bb) • rôzny pomer peptidoglykanu a ostatných súčastí:

9. G+ bakteriálna bunka • Hrubá, mnohovrstiev peptidoglykanu spojených s kyselinou teichoovou ( polyméry glycerolu, fosfátov, ribitolu, lipidov) a povrchovými proteinmi • Lyzozým(v slinách..) rozkladá 1,4, glykosidickú väzbu

10. G- bakteriálna bunka • Tenká vrstva peptidoglykanu - tzv vnútorná stena • Tzv. vonkajšia membrány:lipidová dvojvrstva - fosfolipidy (vnútorná časť dvojvrstvy) - lipopolysacharid (vonkajšia časť dvojvrstvy) LPS = lipid A - cora - polysacharid O Ag endotoxínové vlastnosti • Periplazmatický priestor - želatínová hmota medzi peptidoglykanom a plazmatickou membránou

11. Baktérie bez bunkovej steny-rezistencia na PNC ATB • Mykoplazmy - prirodzene nemajú bunkovú stenu, ich plazmatická membrána obsahuje steroly - pevnosť. Osmotická stabilita - aktívny transport Na+ • L formy - formy baktérií bez b. steny, reverzibilné, vznikajú aj v priebehu infekcie, - sféroplasty G- - protoplasty G+

12. Cytoplazma • Koloidný roztok: vody, DNK RNK, enzýmov, aminokyselín, organických a anorganických látok, minerálov. • Bakteriálny metabolizmus - katabolizmus (živín, ktoré boli bakteriálnymi exoenzýmami rozložená na menšie molekuly, aby mohli byť transportované do baktérie) - anabolizmu (syntéza vlastných molekúl za účasti endoenzýmov) • Nukleoid, ribozómy, plazmidy, endospóry, inklúzie

13. Jadrová hmota • Genetický materiál (genóm) = cirkulárna DNK = jedna molekula dvojvláknovej DNA, ktorej konce sú kovalentne viazané navzájom =jadrová hmota (bakteriálny chromozóm) = nukleoid = gény kódujúce syntézu proteinov • Extrachromozolmálna DNA - molekuly DNA lokalizované v cytoplazme mimo nukleoid - plazmidy - kódujú vlastnosti, ktoré nie sú nevyhnutné pre život, ale poskytujú výhodu • Transpozóny - úseky DNA v nukleoide alebo plazmide schopné premiestnenia na iné miesto

14. Ribozómy, inklúzie,vakuoly • Zloženie: rRNK + proteiny • Štruktúra: 2 podjednotky s rôznou sedimentačnou konštantou - 30S a 50S (Svedbergova jednotka) - jedinečné v prírode, odlišné od eukaryotických buniek - selektívne pôsobenie niektorých ATB • Proteosyntéza • Zásobné granuly glykogénu, škrobu, sírové granuly, volutínové granuly. • Význam pre metabolizmus a diagnostiku

15. Endospóry a sporulácia • Kľudové štádium života niektorých bakteriálnych druhov z rodu Bacillus a Clostridium • Vysokorezistentné - nepriepustnosť obalu, kontrola dezinfekčných prístrojov • Sporulácia - v jednej vegetatívnej bunke vznikne jedna spóra ( replikácia DNK, vytvorenie septa, vytvorenie obalov prípadne exospória, rozpad zbytku vegetatívnej bunky a uvoľnenie do prostredia) • Germinácia - spóry nie sú škodlivé pokiaľ negerminujú - aktivácia ( zmena teploty, alanín) - nasávanie vody

16. Význam spór a nepravé spóry • Význam - prenos ochorení - antrax, tetanus, botulizmus, plynová gangréna - diagnostika - charakteristické umiestnenie v bunke, nefarbia sa Gramom Wirtz Conklinovo farbenie • Exospóry - termostabilné útvary vzniknuté pučaním • Cysty proti vyschnutiu odolné útvary vo vnútri vegetatívnych buniek • Conídia - termolabilné reprodukčné orgány baktérií zo skupiny Actinomycetes

17. Púzdro a S vrstvy • Púzdro - Extracelulárna hmota produkovaná baktériami pevne priliehajúca k b. stene - obvykle polysacharidové, imunogénna ,rôzne antigénne typy bakteriálneho druhu na základe chem. štruktúry, • Význam - antifagocytárne účinky, zábrana vstupu ATB, nástroj virulencie, zvl. u detí do 3. roku, • Dôkaz - Burriho farbenie, aglutinácia, mukózny vzhľad, • Bacillus anthracis (proteinové púzdro),Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, • S vrstva - Extracelulárna amorfná, nejednotná hmota rôznej hustoty a hrúbky

18. Bičíky Dôkaz existencie bičíkov na základe dôkazu pohybu baktérie: - natívny preparát - kultivácia v U rúrke, - rast mimo miesta v pichu, - Raussov fenomén • Nástroj pohybu - rotácia bičíku • Usporiadanie - monotrichálne - amfitrichálne - lofotrichálne - peritrichálne • Štruktúra - vlákno - dutá helikálna proteinová štruktúra (flagelín, H antigén) vytvárajúca kôru - hák - flexibilné spojenie vlákna a bazálneho telesa - bazálne teleso - upevnenie bičíka do b.steny a membrány

19. Fimbrie • Mnohopočetné vlasovité útvary na povrchu bakteriálnej bunky • Adherencia mikroorganizmu k inej bunke - bakteriálnej, ľudskej, alebo na neživé materiály - schopnosť odolať odplaveniu prúdom moču - kolonizácia moč. ciest E. coli • Nástroj patogenity aj virulencie

20. Pilli • Extracelulárne prominujúce útvary G- baktérií spájajúce baktérie do párov ( sex pilli) a podieľajúce sa na prenose genetickej informácie konjugáciou. • Ich tvorba je často kódovaná v génoch plazmidov spolu s vlastnosťou, ktorú majú preniesť ( rezistencia na ATB) • Sú dlhšie ako fimbrie a je ich obvykle menej

21. Základné tvary • Guľovitý - koky - streptokoky, stafylokoky, diplokoky, neissérie - usporiadanie • Pozdĺžny - paličky (tyčinky), bacily - radenie, pomer dĺžky a hrúbky • Ohnutý a špirálovitý - spirochéty, spirily, vibriá, kampylobaktery, helikobaktery - počet závitov, hustota, nasmerovanie koncov (Leptospira interrogans - ?)

22. Fyziológia a metabolizmus baktérií • Metabolizmus • - katabolizmus a získavanie energie • -anabolizmus - biosyntéza – proteosyntéza • - ATB produkcia • - rast a rozmnožovanie • - rastové požiadavky terminológia • - rastová krivka • Využitie znalostí o rastových a nutričných požiadavkách pre diagnostiku

23. Ak chce prežiť, baktéria musí mať účinný systém na tvorbu a získavanie energie: • katabolické - degradačné reakcie - poskytuje základné stavebné jednotky pre anabolické reakcie - vytvára energiu - získava ju z oxidačno redukčných reakcií organických molekúl - je uvoľňovaná v podobe vysokoenergetický fosfátov a skladovaná ako ATP na syntézu všetkých potrebných molekúl • anabolické - syntetické procesy

24. Základné nutričné požiadavky - rovnaké u všetkých živých buniek • Špecifické rastové požiadavky - u prokaryotických buniek existuje veľká diverzita • Mimoriadne rastové faktory - baktérie môžu využívať pripravené komponenty hostiteľského metabolizmu - metabolická adaptácia na jedného prirodzeného hostiteľa - adaptačná schopnosť baktérii, prežívanie na umelých médiách

25. Rastové požiadavky baktérií • Zdroje enrgie, organického uhlíka, kovov (Fe), optimálna teplota, pH, prijateľnosť kyslíka - filné, - trofné, - tolerantné • C - anorganický, CO2 - autotrofné (litotrofné) - organický – heterotrofné (organotrofné) • Teplota - termofilné, - psychrofilné • pH - obvykle vyžadujúce fyziologické neutrálne pH, niektoré baktérie môžu byť - acidofilné, - alkalofilné

26. Požiadavka na dusík - enzymatická deaminácia aminokyselín- metabolizmus proteínov • Fosfor - dôležitý pre tvorbu ATP, nukleových kyselín a koenzýmov • Železo - súčasť cytochrómoxidázového systému, význam pre rast • Znalosti nutričných zvláštností baktérie umožňujú vytvoriť umelé ultivačné médium vhodné pre rast baktérie na umelých médiách

27. Požiadavka na kyslík • Na rozdiel od živočíšnej bunky, nie všetky baktérie striktne vyžadujú prostredie s kyslíkom • Obligátne anaeróbne – vyžadujú prostredie bez kyslíka, kyslík je pre ne toxický – typ metabolizmu je fermentácia - nedostatok niektorých enzýmov na rozklad a detoxikáciu napr. peroxidu vodíka • Anaerobne aerotolerantné – anaeróbna respirácia (fermentácia), prežívanie aj za prítomnosti kyslíka • Obligátne aeróbne – vyžadujú kyslík – typ metabolizmu oxidatívna fosforylácia (respirácia) • Fakultatívne anaeróbne– znášajú kyslík aj bezkyslíkaté prostredie – fermentácia a respirácia • Mikroaerofilné – vyžadujú znížený obsah kyslíka v prostredí. Normálny obsah kyslíka je pre ne toxický

28. Nutričné faktory • Zdroje z prostredia predstavuú obvykle veľké molekuly, ktoré neprejdú plazmatickou membránou • Prvý krok metabolizmu baktérií prebieha extracelulárne hydrolýzou makromolekúl bakteriálnymi exoenzýmami • Hydrolyzované súčasti makromolekúl sú importované cez plazmatickú membránu a bakteriálnu stenu do cytoplazmy - transportné proteiny, poríny • Katabolické reakcie s pomocou endoenzýmov - získavanie energie, bazálnych molekúl - konverzia molekúl na medziprodukty potrebné na získavanie energie alebo pre • Anaboliké reakcie - biosyntéza - peptidoglykanu, lipopolysacharidu, nukleových kyselín, proteosyntéza….

29. Rastová krivka • 1 lag fáza - adaptačné obdobie, možný pokles žijúcich baktérií • 2 fáza zrýchleného rastu - prežívajúce bakteriálne bunky sa začínajú deliť • 3 exponenciálna fáza rastu - najrýchlejšie pomnožovanie • 4 stacionárna fáza - prostredie sa stáva nevhodným, počet nových buniek nahradí počet odumretých • 5 fáza poklesu - počet odumretých buniek je vyšší jako počet živých • 6 exponenciá fáza - poklesu - maximálna rýchlosť odumierania, za časovú jednotku sa počet buniek zníži o polovicu • autosterilizácia

30. Rastová krivka

31. Kinetika rastu • Baktérie sa delia binárnym delením zaškrtením - log funkcia v čase maximálneho rastu - exponenciálna fáza - kontinuálny rast za optimálnych podmienok • Generačný čas in vitro: - 20 minút u Vibrio cholerae (z 1 bunky za 2 dni vznikne bunková hmota presahujúca 4000 krát hmotu zeme) -14 hodín u Mycobacterium tuberculosis, - bunky cicavcov sa delia každých 8 hodín in vivo je generačný čas baktérií dlhší- sila hostiteľskej imunity a obmedzenie nutričných faktorov

32. Stacionárna kultivácia • Kultivácia v laboratóriu: - Limitovaný obsah nutričných faktorov (presná výška agaru ) - stacionárna fáza - viditelné izolované kolónie rastú z CFU - kolóniu tvoriaca jednotka - tkanivo alebo biologický materiál, z ktorého vyrastie 1 kolónia obsahujúca niekoľko tisíc baktérií

33. Kultivácia • Na identifikáciu patogéna je potrebné preniesť ho v biologickej vzorke z miesta infekcie na umelé médium a vytvoriť mu vyhovujúce prostredie • Čistá kultúra - kolónie jediného bakteriálneho druhu alebo typu sa podrobia panelu testov na identifikáciu neznámej kolónie • Toto je možné u veľkej väčšiny baktérií a húb, ktoré rastú na umelých médiách a sú biochemicky aktívne = priamy dôkaz patogéna - vizualizácia • Kultivácia nie je možná u vírusov - nerastú na umelých médiách, vyžadujú živé systémy pre svoj rast Identifikácia vyvolávateľa sa robí nepriamo na základe stanovenia protilátok

34. Identifikácia neznámej kolónie • Mikroskopia natívneho preparátu (pohyb) alebo Gramom zafarbeného preparátu (morfológia, štruktúra b. steny) G+,G-,paličky, koky, špirály • Usporiadanie: napr. diplococcus, streptococcus • Detekcia púzdra (agglutinácia, Burri) • Schopnosť fermentácie substrátov - cukry, aminokyseliny- (biochemické vlastnosti) • Identifikácia enzýmov- (fyziológia baktérie) citlivosť na ATB, a lýzu bakteriofágom • požiadavky na kyslík

35. Genetika baktérií • Replikácia -DNA - prenos vlastností • Regulácia • Zmena vlastností - mutácie • - výmena génov, - bakteriofágy • Genetické inžinierstvo v medicíne • Využitie pre diagnostiku

36. Genetický materiál - DNA • Bakteriálna bunka - DNA - genetické informácie uložené: * v nukleoide - cirkulárny dvojvláknový chromozóm * v plazmide • Replikácia DNA prebieha - obojsmerne - nukleotid - jednosmerne - plazmid

37. Plasmidy • Extrachromozomálne genetické jednotky • Replikujúce sa samostatne • nekóduje vitálne funkcie a vlastnosti • nadstavbové genetické informácie • Genotyp - súbor genetických informácii • Fenotyp - súbor vlastností, ktoré sa prejavia

38. Typy plazmidov a ich význam • Veľké plazmidy - napr. faktor plodnosti (fertility factor, F), faktor prenosu rezistencie - (resistance transfer factor RTF) - nesú informáciu pre *vlastnosť, *vytvorenie nástroja prenosu - pillus *mechanizmus prenosu - konjugácia • Menšie plazmidy - nekonjugatívne - nenesú informáciu pre vytvorenie proteinu prenosu • Šírenie informácie konjugáciou, transdukciou, inkorporáciou

39. Replikácia DNK - podmienka prenosu informácie • Transkripcia - prepis pôvodnej informácie z DNA do mRNA • Translácia - preklad informácie z mRNA prostredníctvom tRNA na bielkoviny

40. Regulácia expresie - prejavenia sa - genetickej informácie • Bunka aj bakteriálna musí byť schopná sa adaptovať na meniace sa podmienky: - má základné regulačné mechanizmy - musí minimalizovať energetické nároky - byť schopná sa vypnúť alebo zapnúť podľa potreby • Zoskupenie génov, ktoré kódujú enzýmy jednej metabolickej cesty OPERON: promótor, gény, terminátor sú koordinovane regulované, prepísané aj preložené

41. Regulácia traskripcie • 1) Gény sa prepisujú dovtedy, pokiaľ nie je prepis zablokovaný represorom - negatívna kontrola - (enzým sa produkuje až, kým nie je jeho produkcia zablokovaná nadbytkom produktu) • 2) Gény sa nezačnú prepisovať pokiaľ nie je prítomný induktor - aktívny regulačný protein - pozitívna kontrola - (enzým sa nezačne produkovať, ak nie je v prostredí substrát, na ktorý by pôsobil)

42. Zmena genetickej informácie • Mutácia - náhodné poškodenie DNA. DNA obsahuje reparačný systém • Výmena génov - rekombinácia

43. Pôvod mutácií • Spontánne • Indukované - teplo - ultrafialové svetlo - ionizujúce žiarenie - chemické mutagény - analógy nukleotidových báz = štrukturálna podobnosť

44. Výmena a prenos genetickej informácie • Medzi bakteriálnymi bunkami 1) transformáciou - inkorporácia exogénnej DNA 2) transdukcia - prenos z jednej baktérie do ďalších bakteriofágom - vírusom baktérie 3) konjugáciou -akoby sexuálna výmena - prenos informácie z jednej baktérie do druhej prostredníctvom pillusu • Prenesené gény sú často integrované do DNA nukleoidu alebo plazmidu a prenášané na dcérske bunky

45. Bakteriofág • vírus bakteriálnej bunky, využíva ich energetický systém a syntézu proteinov. Baktériu infikuje len nukleová kyselina, ktorá sa replikuje a môže dôjsť k rekombinácii medzi NK baktérie a fágu.

47. Životný cyklus bakteriofágov • lytický - po napadnutí bunky a replikácii fágovej NK dôjde k lýze bunky.Nové fágy sú virulentné, napádajú ďalšie baktérie • lysogénny - nelytický - fágová DNA je integrovaná do NK baktérie - temperovaný fág - po viacerých generáciách dôjde ku konverziii a zmene na virulentý

48. Genetické inžinierstvo v mikrobiológii • Vytvorenie vektorov alebo nástrojov schopných klonovať rôzne DNA sekvencie • Eukaryotické gény môžu byť prenesené a exprimované prokaryotickými systémami • Mnohé genetické metabolické ochorenia sú spôsobené chýbaním enzýmov a proteinov - ich produkcia bakériami • Produkcia rekombinantných vakcín baktériami

49. Využitie molekulárnych a genetických technológií v diagnostike mikrobiálnych infekcií • *Využitie genetických sond na diagnostiku ochorení - nukleová kyselina - typická pre ochorenie je inkorporovaná do baktérie, kde je pomnožená, označená napr. radionuklidom, fluorescenčným farbivom, aby sa dala detekovať • *in situ hybridizácia - pomnoženie genetickej informácie vírusu priamo v odobratom tkanive *PCR - vytvorenie miliónov kópií nukleovej kyseliny alebo typickej sekvencie suspektného mikroorganizmu

50. Fyziológia a metabolizmus baktérií • Metabolizmus • - katabolizmus a získavanie energie • -anabolizmus - biosyntéza – proteosyntéza • - ATB produkcia • - rast a rozmnožovanie • - rastové požiadavky terminológia • - rastová krivka • Využitie znalostí o rastových a nutričných požiadavkách pre diagnostiku