Outline Lecture 3 Advantages/Disadvantages of Monoclonal Antibodies

1. Outline Lecture 3 Advantages/Disadvantages of Monoclonal Antibodies Types of Monoclonal Antibodies www.ajahntechno.wordpress.com

2. ข้อดี Monoclonal Antibodies • ใช้ Ag น้อย และมีความบริสุทธิ์พอประมาณในการฉีดกระตุ้น เนื่องจากสามารถเลือกเซลล์ที่มีความจำเพาะเจาะจงต่อ Ag ที่ต้องการได้ในระหว่างการทำ cell cloning ในการฉีดกระตุ้นหนู สามารถใช้ Ag ประมาณ 100 micrograms หรือน้อยกว่าก็ได้

3. ในแต่ละครั้งที่ผลิต สามารถผลิต monoclonal antibodies ที่มีลักษณะเหมือนกัน (homogeneous) เป็นมาตรฐาน (Standardization) และในปริมาณที่ต้องการไม่จำกัดได้

4. เซลล์ที่สร้าง monoclonal antibodies สามารถเก็บไว้เป็นเวลานานเป็นปีๆ ในสารละลายไนโตรเจนเหลว และนำกลับมาเลี้ยงเพื่อผลิต monoclonal antibodies ได้อีก

5. Cryopreservationเปนเทคนิคที่ใชในการเก็บรักษาเซลลหรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต ทั้งเซลลของมนุษย สัตว พืชและเชื้อจุลินทรียตางๆ ภายใตสภาวะอุณหภูมิที่เย็นจัด(Ultra low temperature) • เก็บรักษาเซลลหรือเนื้อเยื่อใหไดเป็นระยะเวลานาน (Long term preservation) • หลักการของเทคนิคนี้ คือ การทําใหน้ำภายในเซลลเปลี่ยนสถานะไปเปนของเหลวหนืด ไมผ่านขั้น • ตอนการเปนผลึกน้ำแข็ง ซึ่งผลึกน้ำแข็งดังกลาวนี้จะมีผลทําให Viability ของเซลลลดลง โดยใชสารCryoprotective agent เป็นตัวช่วย • ป้องกันไมใหเกิดผลึกน้ำแข็งขึ้นภายในเซลล เมื่อทําการลดอุณหภูมิของเซลลต่ำลงไปจนถึงจุดวิกฤต
(Critical point) คือ -135 องศาเซลเซียส เซลลก็จะกลายเปนของแข็งมีลักษณะเหมือนแกว และสามารถเก็บรักษาเซลลไดนานถึง 20 ป • Cryoprotectiveagents • - ลดปัญหาการเกิดเซลล์หดตัว ในช่วงการลดอุณหภูมิลง
- ลดการแตกตัวของสารละลาย ที่เกิดจากการแข็งตัวในช่วงที่ลดอุณหภูมิลง
- ลดการเกิดผลึกน้ำแข็งขึ้นภายในเซลลสารเคมีที่นิยมนํามาใชเป็น Cryoprotective agent   เช่น DMSO, polyvinylpyrrolidone, Dextrans,Glycols และ glycerol เป็นต้น

6. มีความจำเพาะสูงมาก (High Specificity) โดย monoclonal antibodies จะเข้าทำปฏิกิริยากับantigenic determinant (epitope) เพียงตำแหน่งเดียวบนโมเลกุลของ Ag ดังนั้น monoclonal antibodies จึงสามารถใชัจำแนกสายพันธุ์ของเชื้อจุลินทรีย์หรือศึกษาลักษณะของโมเลกุลของ Agได้

7. มีaffinity สูงต่อ Ag เนื่องจาก monoclonal antibodies มี affinity สูงนี้จะสามารถถูกใช้ในลักษณะที่มีความเข้มข้นตํ่า จึงทำให้ลดปฏิกิริยารบกวน (background) ในการทดลองลงได้

8. ข้อเสีย Monoclonal Antibodies - การผลิต monoclonal antibodies มีกรรมวิธีที่ค่อนข้างยาก ซับซ้อน ต้องใช้เวลา และ ค่าใช้จ่ายแพงกว่าการผลิต polyclonal antibodies

9. - เนื่องจาก monoclonal antibodies มี ความจำเพาะสูงมากจึงมีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของ Ag ที่เกิดขึ้นระหว่างที่ Ag เกาะกับพื้นผิว (solid phase) หรือ สภาวะที่ใช้ในการทำการทดลอง

10. - เนื่องจาก monoclonal antibodies ในบางชนิดมีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงของ pH, ionic strength และสิ่งแวดล้อมอื่นๆ จึงทำให้ monoclonal antibodies เกิดการเปลี่ยนแปลงได้ง่ายในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์

11. - monoclonal antibodies หลายชนิดไม่สามารถทำปฏิกิริยาบางอย่างเช่นปฏิกิริยาการตกตะกอน (Precipitation) ได้ The Ag must have at least two copies of the same epitope, or have different epitopes that react with different antibodies present in polyclonal antisera

12. Types of Monoclonal Antibodies (Mabs) The Chimera composed of the parts of three animals — a lion, a snake and a goat. Usually depicted as a lion, with the head of a goat arising from its back, and a tail that ended in a snake's head

13. monkeys used for immunization are the source of the variable domains. The more human the antibody is, the less likely it will generate an immune response and the more utility it has for chronic (repeat) therapy. เป็นวงศ์ย่อยของสัตว์ฟันแทะ

15. Types of mAbs Bluedenotes human component Orangemurine component

16. โมโนโคลนอลแอนติบอดี ถือเป็นสารที่พัฒนาด้วยวิธีการทางวิศวพันธุศาสตร์ แบ่งเป็น1. chimeric antibody ซึ่งเกิดจากการตัดต่อพันธุกรรม DNA ของมนุษย์และหนู (murine) โดยมีสัดส่วนที่มาจากมนุษย์ 65-90% 
2. humanized antibody ซึ่งมีสัดส่วนที่มาจากมนุษย์ 95%  
3. fully human antibody เป็นส่วนของมนุษย์ทั้งหมด 
     ซึ่งการยิ่งทำให้แอนติบอดีที่ได้ใกล้เคียงกับมนุษย์มากเท่าใด ก็จะลดปัญหาการเกิดปฏิกิริยาการแพ้ได้มากเท่านั้น  โมโนโคลนอล แอนติบอดี เหล่านี้ จะเห็น epitobe เดียวเท่านั้น จะไม่ไปจับกับเซลล์อื่นที่ไม่ต้องการอีก ทำให้เกิดความจำเพาะเจาะจงต่อการออกฤทธิ์ของยามากขึ้น จึงถือเป็นกลุ่มโมเลกุลาทาร์เก็ต (molecular target) คือ ออกฤทธิ์จำเพาะต่อโมเลกุล ซึ่งโมเลกุลาทาร์เก็ตที่ดีในการรักษามะเร็งนั้น ควรมีคุณสมบัติดังต่อไปนี้ 
1. มีความจำเพาะต่อเซลล์มะเร็ง ดังนั้นควรศึกษาให้ทราบถึงเฉพาะเซลล์มะเร็งจะพบตัวรับแบบนี้เท่านั้น ซึ่งหาไม่เจอในเซลล์ปกติ
2. มีผลตอบสนองต่อการรักษาเมื่อนำมาใช้จริง

17. First Generation: Murine MAbs • Derived from mice • Patients treated with murine mAbs develop a human anti-mouse antibody (HAMA) response • Rapid clearance of the mAb • Hypersensitivity reactions • Adverse events serum sickness or anaphylaxis • Ibritumomab • Tositumomab

18. The HAMA response is essentially an allergic reaction: a mild form, like a rash, to a more extreme and life-threatening response, such as renal failure.

19. Origin Second generation • DNA technology or genetic engineering used to construct hybrids composed of human Abs regions with murine • Chimeric Abs • Humanized Abs • Human Abs

20. PROBLEMS • HAMA Response. • Loss of effector functions.

21. SOLUTIONS • Production of human Mab. • Make mouse Ab more “human-like”

22. Chimeric Abs Antigen binding parts (variable region) of mouse Abwith effector parts (constant region) of human • Infliximab • Abciximab • Rituximab

24. VARIABILITY PLOT CHIMERIC HUMAN/MOUSE Mouse CONSTANT FR1 FR2 FR3 FR4 CDR1 CDR2 CDR3 CONSTANT Human Chimeric CONSTANT FR1 FR2 FR3 FR4 CDR1 CDR2 CDR3

25. Humanized Human Ab with complimentary determining region (CDR) or hypervariable region from non-human source • Daclizumab • Trastuzumab

26. HUMANIZED ANTIBODIES Mouse CONSTANT FR1 FR2 FR3 FR4 CDR1 CDR2 CDR3 CONSTANT Human Humanized CONSTANT FR1 FR2 FR3 FR4 CDR1 CDR2 CDR3

27. Human Abs Recombinant DNA technology: • Genes for variable Fab portion of human Abs is inserted in genome of bacteriophages & replicated • Mixed with Ag & complementary Ab producing phages selected e.g. Adalimumab

28. เทคนิค “ฟาจดิสเพลย์” (Phage Display Technology) คือการนำยีนที่เก็บรหัสการสร้างโมเลกุลแอนติบอดีจากลิมโฟซัยท์บีของคนมาเชื่อมต่อกับพันธุกรรมของไวรัส (ฟาจ) ของแบคทีเรียชนิด อี.โคไล เมื่อนำไวรัสหรือฟาจที่มีพันธุกรรมของลิมโฟซัยท์บีไปเลี้ยงในแบคทีเรียชนิด อี.โคไล แบคทีเรียจะผลิตฟาจที่มีลิมโฟซัยท์บีออกมา ทำให้ฟาจมีสภาพเหมือนลิมโฟซัยท์บี ซึ่งสามารถเพิ่มจำนวนในแบคทีเรียได้อย่างไม่จำกัดในช่วงเวลาข้ามคืนซึ่งเรียกว่าเป็น “คลังฟาจสำหรับผลิตแอนติบอดีของคน หรือระบบฟาจดิสเพลย์” (Human antibody phage)

29. http://www.crucell.com/Technology%20-%20Antibody%20Technology%20-%20Historyhttp://www.crucell.com/Technology%20-%20Antibody%20Technology%20-%20History

30. ประโยชน์ของเทคโนโลยีการแสดงโปรตีนบนผิวฟาจเพื่อการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีประโยชน์ของเทคโนโลยีการแสดงโปรตีนบนผิวฟาจเพื่อการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี .       ‪การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีด้วยเทคโนโลยีฟาจ สะดวก และประหยัดกว่าการใช้เทคนิคดั้งเดิม เพราะใช้เวลาน้อยกว่า  ใช้เงินน้อยกว่า ใช้แรงงานและความชำนาญน้อยกว่า  และข้อสำคัญคือไม่ต้องใช้สัตว์ทดลอง‬     ‪สามารถใช้กับแอนติเจนได้หลากหลายชนิดกว่า เพราะสามารถใช้กับแอนติเจนที่เป็นพิษต่อสัตว์ แอนติเจนที่คล้ายกับโปรตีนในสัตว์ทดลอง หรืออาจใช้เซลทั้งเซลเป็นแอนติเจนก็ได้  นอกจากนั้นแล้วยังสามารถใช้กับแอนติเจนที่ไม่สามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของสัตว์ได้ ‬(non-immunogenic antigen)       ‪สามารถประยุกต์ใช้ในการสร้างแอนติบอดีที่มีคุณสมบัติเหมือนของคน ‬(humanized antibody) เพื่อใช้ในการรักษาโรค (therapeutic antibody)       ‪สามารถปรับปรุงให้มีคุณสมบัติเปลี่ยนไปตามต้องการ เช่นมีความสามารถในการจับ หรือความจำเพาะเจาะจงสูงขึ้น หรือทนต่อสภาวะต่างๆ‬      ‪สามารถนำไปผลิตเป็นจำนวนมากได้ง่าย ด้วยเทคนิคการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียโดยทั่วไป เพื่อใช้ในการผลิตในระดับอุตสาหกรรม‬ http://www.sut.ac.th/iat/biotech/montarop/phd/ฟาจแอนติบอดี.htm