1 / 22

Fluorescence a chemiluminiscence

Fluorescence a chemiluminiscence. Skoumalová, Vytášek, Srbová. E. S 0 S 1 T 1. Luminiscence. Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního

zander
Download Presentation

Fluorescence a chemiluminiscence

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Fluorescence a chemiluminiscence Skoumalová, Vytášek, Srbová

  2. E S0 S1 T1 Luminiscence Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního Fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je způsobena absorpcí záření Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí

  3. Fluorescence a fosforescence

  4. E Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram) Nezářivé přechody: VR - vibrační relaxace IC - vnitřní konverze ISC - mezisystémová konverze Zářivé přechody: Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S1S0 (FL)spinově povolený přechod Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T1 S0 (Ph)spinově zakázaný přechod

  5. Stokesův posuv Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii E = h.c/ http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/soubory/principy.htm

  6. vzorek intensita fluorescence If intensita absorpce Ia I0 It f = = Ia = I0 - It If Kvantitativní měření Kvantový výtěžek (f ) < 1

  7. excitační monochromátor vzorek zdroj emisní monochromátor detektor čtecí zařízení Měření fluorescence • Fluorimetry • Spektrofluorimetry • Fluorescenční skenery • Fluorescenční mikroskopy • Průtokové cytometry

  8. Spektrofluorimetr

  9. Spektrofluorimetr

  10. Analýza neznámého vzorku pomocí fluorescenční spektroskopie Erytrocyty (pacienti s Alzheimerovou chorobou)

  11. Fluorescenční mikroskopie Endotelová buňka (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

  12. Faktory ovlivňující citlivost fluorescence • Intenzita zdroje • Účinnost optického systému • Štěrbiny monochromátoru • Citlivost detektoru

  13. Zdroje interference (chyb) 1. Efekt vnitřního filtru vrstvy vzorku vzdálenější od dopadu excitačního záření (dále v kyvetě) jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část záření je absorbována povrchovými vrstvami vzorku 2. Zhášení excitovaná molekula se vrací do základního stavu nezářivým přechodem v důsledku srážky s molekulou zhášedla zhášedla: O2, halogeny (Br, I) • Ramanovy peaky vibrační spektra pozorovaná ve viditelné a UV oblasti

  14. Principyfluorescenčních stanovení 1. Přímé metody měříme přirozenou fluorescenci vzorku 2. Nepřímé metody nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát 3. Zhášecí metody sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku

  15. Přirozené fluorofory • Polyaromatické uhlovodíky • Vitamin A, E • FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH • NADH (340/460 nm) x NAD+ • Karoteny • Chinin • Steroidy • Aromatické aminokyseliny • Nukleotidy • Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein )

  16. Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření)

  17. Fluorescenční značky/sondy Látky jejichž fluorescence se po jejich zavedení do biologického systému nemění akridinová oranž (DNA) fluorescein (proteiny) rhodamin (proteiny) GFP Látky jejichž fluorescence se mění v závislosti na okolí ANS (1-anilonaftalén-8- sulfonát) - polarita prostředí Fura-2 – měření Ca

  18. Příklady využití fluorescenční detekce • Enzymové reakce • Analýza DNA • Genetické manipulace • Imunochemické metody • Transport membránou, fluidita membrán • Proliferace buněk • Apoptóza

  19. Luminol před přidáním H2O2 Chemiluminiscence po přidaní H2O2 Chemiluminiscence

  20. světluška Noctiluca scintillans luciferáza ATP + luciferin + O2 AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světlo Mg 2+ Chemiluminiscence • Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí • Při návratu na základní úroveň dochází k vyzáření světla Bioluminiscence

  21. Ab Ag Chemiluminiscenční stanovení • Stanovení NO NO + O3 NO2* + O2 NO2*  NO2 + světlo • Stanovení H2O2 nebo peroxidasy Luminol + H2O2 3-aminoftalát + světlo peroxidáza využití v imunochemii

  22. Shrnutí: 1. Princip fluorescence - Jablonského diagram 2. Využití fluorescence v medicíně - příklady 3. Chemiluminescence - využití

More Related