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Le séquençage à grande échelle au Genoscope Stratégies actuelles et perspectives. P. Wincker, Séminaire INRA, Paris, 06.11.07. Status: Public Institute Mission : provide high-throughput sequencing data to the French Academic community , and carry out in-house genomic projects Creation 1997
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Le séquençage à grande échelle au Genoscope Stratégies actuelles et perspectives P. Wincker, Séminaire INRA, Paris, 06.11.07
Status: Public Institute • Mission : provide high-throughput sequencing data to the French Academic community , and carry out in-house genomic projects • Creation 1997 • Part of the CEA Institut de Génomique since 05/2007
Procedures on Scientific Projects • in house : evaluated by the Scientific Committee • collaborative: - proposed by external labs (annual call for proposals) - evaluated by the Scientific Committee - supported by Genoscope's budget • shared cost: - consumables and labor supported by applicant - other costs on Genoscope's budget - approval by Scientific committee >100 000 reads • paid services
Breakdown of sequencing activity since 1998 Total reads 41 681 315
Breakdown of sequencing activity in 2006 Total reads 12 138 976 Coûts partagés 1,4%
Successful applications since 1998 Total 188
2001 11 7 43 9 5 26 0 3 6 9 5 16 140 Personnel(01/01/06) • Mapping • Libraries, subcloning • Sequencing + template prepping • Finishing • Development • Research projects • R and D • Robotics • Informatics • Bio-informatics • QC and QA • Infrastructure (Kitchen, building etc.) • TOTAL (FTE) 8 11 18 15 4 27 8 3 21 24 2 9 150
Niveaux d’accès aux capacités du Genoscope par Appel d’Offres Projet Séquençage Sanger, 454 (2007), Solexa (2008) Assemblage, finition, clustering Annotation procaryote (MAGE) Annotation eucaryote (GAZE)
Sélection des projets • Appel d’offres évalué annuellement par un conseil scientifique externe (1998-2007) • A partir de 2008 : • Appel d’offres (GIS Ibisa) • Projets ANR (Programme Génomique)
Sequencing equipment total capacity ABI 3730 19 (30 M bases/day) 454/GSFLX 1 (100 M bases/day)
Evaluation des NTSs au Genoscope • Qualité : des lectures et des assemblages • Applications : fonction de la taille des génomes, complémentarité aux autres technologies • Impact sur l’obtention d’une séquence «finie »
454 data (flowgram) Sanger data (chromatogram)
Evaluation de la qualité des lectures : Mapping des lectures 454 sur la séquence finie d’Acinetobacter baylyi • 478.961 lectures mappées (soit 99,55%) • 98.200.952 nt alignés contenant 1.451.396 erreurs (soit 1,48% d’erreurs) • Avec Q ≥ 20, 790.487 erreurs (8.10-3) et Q ≥ 40, 343520 erreurs (3.10-3) • Sur les 172.668 lectures mappées à 100%, 60.550 sont sans erreurs (35%)
Evaluation des assemblages 454 • Deux types d’assemblage proposés : • De novo • Dirigé (en utilisant la séquence d’un génome très proche)
Taille du N50 à différentes profondeurs (assemblage de novo)
Erreurs concentrées dans les régions homopolymériques • Fonction de la taille de l’homopolymère • Pour M. agalactiae, couverture de 30x • si (N)n avec n<5, taux d’erreur ~1% • si (N)n avec n<9, taux d’erreur ~5% Le taux d’erreur dépend de la fréquence des régions homopolymériques Ce n’est pas une valeur absolue
Evaluation des NTSs au Genoscope • Qualité : des lectures et des assemblages • Applications : fonction de la taille des génomes, complémentarité aux autres technologies • Impact sur l’obtention d’une séquence «finie »
De l’assemblage 454 au génome fini • Points positifs : • Pas de clonage présence des régions incompatibles avec E. coli • Quasi-insensibilité aux biais compositionnels • Vitesse : une semaine de l’ADN à la séquence • Points négatifs: • Pas de liens entre séquences pas de supercontigage • Taux d’erreur élevé dans les homopolymères • pas d’assemblage des séquences répétées
Microbial Genome Sequencing • Until December 2006 : 12x coverage with Sanger technology, 3 libraries (insert sizes 3 kb, 10 kb, 40 kb) • From january 2007 : 4x Sanger coverage, single library (10 or 40 kb) + 20x coverage GS20 reads • Assembly with Arachne (Broad Institute) using Sanger reads and Newbler contigs • From June 2007, 4x Sanger coverage, single library (10 or 40 kb) , + 15x coverage GSFLX reads • Assembly with Arachne (Broad Institute) using Sanger reads and Newbler contigs or with Newbler2 using Sanger reads and GSFLX reads
Le séquenceur Solexa / illumina 1G Amplification directe sur lames (pas de PCR en émulsion) Séquençage par terminateurs reversibles Longueurs de lecture : 25-35 bases Débit : 40 000 000 lectures / run
Applications du Solexa/Illumina 1G (ou ABI Solid) • SNP detection • ChIp-Seq • Quantitative / qualitative transcriptomics • small RNAs • …
Méthodes pour le re-séquençage : environnement informatique • Objectif : aligner chaque lecture à une localisation unique (si elle existe) sur le génome de référence • Exemple si utilisation de blast : • 1 lecture contre 140Mb (chr9 humain) ~ 18s/CPU • 1 lecture contre 3Gb ~ 386s/CPU • 1Gb lectures Solexa contre 3Gb ~ 490 années/CPU • 20x de lectures Solexa contre 3 Gb ~ 44.000 années/CPU • Nécessité d’utiliser des méthodes différentes qui tiennent compte de la petite taille des lectures : • phageAlign : compare chaque lecture avec les k-mers génomique (en triant les k-mers et en exploitant les parties communes des préfixes pour réduire le travail) • ELAND : place les lectures dans une structure de données et les aligne toutes en même temps
Perspectives d’utilisation Solexa / Illumina 1G • Small RNAs, tags … : avantage de coût par rapport au 454/Roche • Séquençage de génomes : attente du développement d’assembleurs adaptés • Amélioration de la qualité des séquences 454/Roche assemblés
Notions de coût par base (ordre de grandeur) Sanger (ABI3730xl) : 1000 euros / Mbase taux d’erreur < 99%, assemblage de qualité à ~10 équivalents, supercontigage immédiat Roche/454 GSFLX : 100 euros / Mbase taux d’erreur > 1% dans les régions homopolymériques, assemblage de qualité à ~20 équivalents, pas de supercontigage Illumina 1G : <10 euros / Mbase taux d’erreur <99.9 % , pas d’assemblage de qualité …
4x 15x 0.5x 10-100x Assemblage, finition Assemblage, finition 15x
Roche / 454 2006 : 20 Mb par run (100 bases par lecture) 2007 : 100 Mb par run (250 bases par lecture) 2008 : 1 Gb par run (500 bases par lecture) Solexa/Illumina 1G 2007 : 1 Gb par run (32 bases par lecture) 2008 : 3 Gb par run (50 bases par lecture, lectures en paires) Evolution accélérée des NTSs Difficile de prévoir quelle technologie sera utilisée pour séquencer un génome dans 1-2 ans …
Vers un séquençage génomique à très bas coût • Dépendra de la capacité à assembler des séquences courtes et peu chères : • Développement de lectures « paired-ends » ? • Allongement des longueurs utiles de type Solexa ? • Baisse des coûts des lectures 454 ? • Amélioration spectaculaire des logiciels d’assemblage ? • Arrivée d’une nouvelle technologie ?
Une perspective très mobile … • Les programmes de comparaison multi-génomes devraient se généraliser • La métagénomique connaîtra un développement exponentiel • De nombreux projets jugés jusqu’alors trop coûteux deviennent réalisables • … Mais toutes ces perspectives nécessitent des progrès pour être envisageables pour des génomes de grande taille
Une perspective très mobile … • Les technologies utilisées peuvent devenir caduques très vite • Les besoins informatiques augmentent considérablement • Risque d’envahissement par des données massives de faible qualité
Director : J. Weissenbach • Sequencing coordination : P. Wincker • Production Sequencing: J. Poulain • Roche / 454 development : C. Cruaud • Informatics: C. Scarpelli, V. Vico, V. Anthouard, J. Leseaux • Assembly : J.M. Aury