Die Mechanik des Zytoskeletts

1. Die Mechanik des Zytoskeletts Maren Funk & Shoh Asano

2. Gliederung • Einleitung • Struktureller Aufbau • Elastizität des Zytoskeletts • Motilität (Zellbewegung) • Mechanosensing • Anwendung: Tumordiagnostik

3. Einleitung Was ist das Zytoskelett? • Protein-Netzwerk im Zellplasma • Keine statische Struktur • Zweck: • Transporte innerhalb der Zelle • Bewegung der Zelle • Stabilität der Zelle • Signalübertragung zwischen Zellen • Wichtig bei Zellteilung • Beinhaltet drei Komponenten/Proteine: • Mikrotubuli (im Bild grün) • Aktin-Filamente (im Bild rot) • Intermediär-Filamente • In allen eukaryotischen Zellen vorhanden; Kann in prokaryotischen vorkommen Floureszenzmikroskopie eines Zytoskelettes einer Drüsenzelle

4. Aufbau des Zytoskelettes

5. Proteinnetzwerk der Zelle schematisch dargestellt

6. Aktin-Filamente Aktin Filament-Netzwerk Mit Myosin dekorierte Aktin Filamente: Die Asymmetrie der Helizes geben uns die Information, wo welche Enden liegen (Pfeil zeigt in „pointed end“ = Minus Ende)

7. Aktin-Filamente • Hauptprotein: Aktin; zwei aus Aktinmonomeren polymerisierte Ketten bilden ein Aktin-Filament (d~7nm) • Die Zelle wird unterhalb der Plasmamembran mit Aktin-Filamenten vernetzt • Auch hier polare Enden mit schnell wachsenden Plus-Ende bzw. langsam wachsenden Minus-Ende • Aktin-Filamente sind rund 30 mal länger als MT • Funktion: • Stabilität durch das Vernetzen mit Verbindungsproteinen • Stofftransport (kurzstreckig) von Vesikeln • Fixierung von Transmembranproteinen (Kanäle, Rezeptoren, etc) • Zellmotilität durch gezielte Polymerisierung sowie Myosin-Aktin WW (Muskelfaser)

8. Intermediär-Filamente Intermediär-Filament-Netzwerk Intermediär-F. (blau eingefärbt) wechselwirken mit Mikrotubuli (rot) durch u.a. Plektin Proteinen (grün)

9. Intermediär-Filamente • Durchmesser: 8-12nm, somit zwischen MT und Aktin-Fil., Aufgebaut aus vers. Faserproteinen • Aufbau: • Zwei Monomere verknüpfen sich parallel zu einem Dimer • Zwei Dimere verknüpfen antiparallel zu einem Tetramer • Mehrere Tetramere verbinden sich parallel zu einer Protofibrille, diese können Bündel bilden (Tonofilamente) • Durchspannt die komplette Zelle • Funktion: • Auch hier Stabilität der Zelle • Fixierung der Zellorganellen • Anders als bei MT und AF nicht beteiligt an Zellmotilität

10. Mikrotubuli Mikrotubuli Netzwerk

11. Mikrotubuli • Röhrenförmige Proteine bestehend aus Alpha- und Beta- Tubulindimere (in Helizes polymerisiert) • Durchmesser: 15-25 nm • Besitzen zwei „unterschiedliche“ Enden (polar): • Am Plus (alpha) Ende findet die Polymerisation schneller statt (im Ggs. Zum Minus (beta) Ende) • Transport (von Vesikeln, Mitochondrien, etc.) findet gerichtet statt (Motorprotein-abhängig) • Bilden sich an dem MTOC und kann dort auch abgelöst werden • Funktion: • Stabilität der Zelle • Stofftransport (Trennung der Chromosomen bei Zellteilung) Bildung der MT Materialtransport an einem MT

12. Gliederung • Einleitung • Struktureller Aufbau • Elastizität des Zytoskeletts • Motilität (Zellbewegung) • Mechanosensing • Anwendung: Tumordiagnostik

13. Rheologie des Zytoskelettes Experimentelle Beobachtungen bei der Viskositätsmessung von F-Aktin TEM-Bild von Aktinnetzwerk

14. Rheologie des Zytoskelettes • Mechanische Eigenschaften beschrieben durch Drücke und daraus entstehenden Spannungen • Viskoelastisches Modul als Materialeigenschaft • Messmethoden: • Ein oszillierendes Magnetfeld wird angelegt; Aus der Verschiebung magnetischer Partikel im System lässt sich eine frequenzabhängige Suszeptibilität schließen. Diese wird dann umgerechnet in das lokale Ve.Modul. • Gleiches Prinzip: oszillatorische Spannungen und die entstehenden Drücke messen • Durch das Spektrum der thermischen Bewegung (wird näher beleuchtet) • Viskoelastisches Modul beschrieben durch komplexe Zahl G*(ω), wobei gilt: • G*(ω)= G‘+ i G‘‘ mit G‘ als „storage“ (Elastizitäts-) und G‘‘ als „loss“ (Verlust-) Modul

15. Schwierigkeiten einer einheitlichen Elastizitätstheorie Drei verschiedene Aktin-Filament Strukturen und ihre Struktur

16. Theoretische Modelle der Polymerphysik • Gummiband-Theorie nicht mehr anwendbar • Benötigen Modelle für semiflexible Polymere (Filamente) • Auftretende Schwierigkeiten: • anisotropes Ansprechverhalten auf angewandte Drücke • Wege der Kraftübertragung: • Viskose Kupplung zwischen Filamenten und Lösung • Räumliche Wechselwirkungen zwischen Filamenten (z.B. Kollisionen) • Modell anhand eines Einzelfilamentes, da WW zwischen Filamenten vernachlässigbar ist

17. Schlauchmodell • Jedes Polymer ist von vielen anderen umgeben, somit Einschränkung der Bewegungsfreiheit • Ebenfalls Einschränkungen der Wellenbewegung von größeren Längenskalen • Theoretisch/Experimentell wurde ein Modell erschaffen, in der Kontur und Dicke des Schlauches durch Krümmungsenergie (eine gerader, dünner Schlauch) und Entropie (dicker, kurviger Schlauch) bestimmt wird • Charakterische Größe Le, unter der man den Schlauch als gerade ansehen kann • Nachteil: keine Behandlung von Crosslink Netzwerk möglich • d ist der Schlauchdurchmesser • Le die Verfilzungslänge • ξ die Maschengröße

18. Messmethode: „Two-Point Microrheology“ (2000) • Zweck: Bestimmung des komplexen Schermoduls G*(ω) • (Fluoreszierende) Tracer Partikel (~1 µm) werden in das Medium eingeführt • Mit Videomikroskopie/Interferometrie wird die Brownsche Bewegung aufgenommen • Bei ve. Stoffen diffundiert der Tracer nicht heraus, weiterhin hängt die Bewegung von der Elastizität ab • Vorteile: • man braucht nur sehr kleine Testvolumina • Inhomogenitäten sind erkennbar • Unabhängig von Tracer Größe und Form • Günstiger als ein mechanisches Rheometer Diffusion von Partikeln in Wasser Brownsche Bewegung bei Wasser (links) und DNA (rechts)

19. Die Physik hinter der Messung • Energiebilanz eines Tracerpartikels: • Thermodynamik: pro Freiheitsgrad ½ kBT an thermischer Energie • “Elastische” Energie (vgl. Federenergie): K <x²> • Somit gilt (bei langen dt): ½ kB T = K <x²> dt • “Federkonstante” K nährungsweise proportional zum Schermodul • Messung/Berechnung von <x²> erweist sich als schwierig, da zwischen dt und <x²> meist kein linearer Zusammenhang besteht • “Two-Point”: Man misst die Korrelationen zwischen zwei Partikelbewegungen und erkennt: • ~ 1/x, wobei x: Abstand der zwei Partikel • ~ zum Schermodul des Materials • Messung der brownsche, als auch korrelierte Bewegung, wobei erstere bei der Mittelbildung wegfällt • Der Abfall beträgt stets ~ 1/x, somit kann man auf Inhomogenitäten schließen

20. Schematisches Diagramm

21. Elastizität des Cytoskeletts Elastizität ist grundlegend abhängig von der Struktur im Zytoskelett: • „Grundgerüst“: Messung des Schermoduls anhand der Messung in einer Aktin-Lösung • Verfeinerung des Experimentes mithilfe von Crosslinkern eines Types → Trotz der Verfeinerung ist man derzeit immernoch nicht in der Lage, ein gültiges Modell für das Protein Netzwerk aufzustellen → Bei starken Vereinfachungen (Crosslinker haften fest und fallen nicht ab), lassen sich Modelle (z.B. Gummi-Elastizität) darauf anwenden

22. Gliederung • Einleitung • Struktureller Aufbau • Elastizität des Zytoskeletts • Motilität (Zellbewegung) • Mechanosensing • Anwendung: Tumordiagnostik

23. Wofür Zellbewegung / Zellmigration + Immunantwort + Reparation von Gewebe (z.B. Nervenregeneration) • chronische Entzündungen • Tumor und Metastasenbildung Evt. Gewebe züchten Evt. Zelltransplantationen

24. Zellmotilität (Zellbeweglichkeit) • große Unterschiede in der Elastizität in der Zelle • Zellmotilität funktioniert unabhängig vom Zellkern und den meisten Zellorganellen • Komplexes Zusammenspiel vieler Bestandteile • Lokale Aktivierung verschiedener Crosslinker ermöglicht eine dynamische Erzeugung lokalisierter Meso-Strukturen

25. Vorgang der Zellmigration • Externes chemotactisches Signal • Signal wird ins Zellinnere geleitet • Lokale Aktivierung von Crosslinkern • Und polymerisation von Aktin (thermisch getrieben) • Fortsatzbildung • Ausbildung eines Bogens • Anheften an das Substrat (spezielle Komplexe sammeln sich an) • Der Zellkörper wird durch Actomyosin-Filamente nach vorne gezogen • Der letzte „Fuß“ wird losgelassen und nach vorne gezogen

26. Richtungsfindung • Der Fortsatz selber ist hart • Die Vorschubkräfte sind aber klein • Ab 300 Pa Widerstand zieht sich der Fortsatz ein Stück zurück und ändert dann zufällig seine Wachstumsrichtung • Durch Druck auf die Zellmembran werden Ca2+ Kanäle geöffnet. • Ca2+ aktiviert Gelsolin, das die Depolimerisation von Aktin bewirkt

27. Gliederung • Einleitung • Struktureller Aufbau • Elastizität des Zytoskeletts • Motilität (Zellbewegung) • Mechanosensing • Anwendung: Tumordiagnostik

28. Mechanosensing • Eine Antwort auf mechanische Reize erfordert generell drei (nicht notwendigerweise verschiedene) Komponenten: • Eine Komponente, die direkt durch Krafteinwirkung verändert wird (Sensor) • Eine Komponente, die die Information zum Erfolgsorgan bringt • Ein Erfolgsorgan • Das Zytoskelett kann Aufgaben in allen drei Komponenten übernehmen.

29. Zytoskelett als Teil eines mechanischen Sensors • An gedehntes und nicht gedehntes Zytoskelett können unterschiedliche Proteine binden (Erfolgsorgan) • Druck auf die Zelle kann sich auf die Transkription von Zytoskelett-proteinen auswirken. • Das Zytoskelett ist dafür geeignet, Kraft in weit entfernte Regionen der Zelle weiter zu geben. Z.B. entstehen chemische Stoffe an anderen Stellen als die Kraft ausgeübt wird. • Transmembranproteine enthüllen bei Krafteinwirkung Schlüsselstellen, an die Zytoskelett-Linker anbinden können. Diese Konformationsänderung und eine höhere Konzentration von den Komplexen für die Adhäsion helfen Zelle größere Kräfte auszuüben. Z.B. bei steifem Untergrund

30. Prüfen des Zelluntergrunds • Viele Zellen wachsen nur auf einem Untergrund gut, der die gleiche Steifigkeit hat, wie sie selbst. • Z.B. zeigt Zellwachstum auf weichem Agar-Gel Krebszellen an. • Zellen überprüfen ihre Umgebung, indem sie daran ziehen (Kontraktion durch Myosin) und auf gute Adhäsion (Anhaften an den Untergrund). • Wenn man das Myosin blockiert, erkennen die Zellen harten Untergrund nicht mehr. • Sie passen sich in gewissem Maß an den Untergrund an.

31. Prüfen des Zelluntergrunds • Zellen auf weichem Untergrund müssen weniger Kraft zum Zusammenziehen und lassen sich deshalb leichter wieder ablösen. • Auch die Adhäsion ist bei weichem Grund dynamischer. • Zellen zeigen auf hartem Grund mehr, zu großen Streben organisiertes, F-aktin. • Sehr bewegliche Zellen, wie die Fresszellen im Blut haben keinen bevorzugten Untergrund. Sie wachsen in Flüssigkeiten genau so gut wie in Glasschalen.

32. Gliederung • Einleitung • Struktureller Aufbau • Elastizität des Zytoskeletts • Motilität (Zellbewegung) • Mechanosensing • Anwendung: Tumordiagnostik

33. Eigenschaften von Tumorzellen • Tumorzellen sind dedifferenziert (stammzellenähnlich) und viel weicher als ausdifferenzierte Zellen. • Je weicher sie sind, desto eher können sie wandern und Metastasen bilden. • Die Elastizität ist ein Merkmal, das mit am stärksten zwischen Tumor- und normalen Zellen variiert.

34. Prinzip des Testgeräts • Mit optischen Fallen kann man durch den Strahlungsdruck des Lichtes Partikel fangen und Kräfte im pN Bereich auf sie ausüben. • Zwei entgegengerichtete NICHT fokussierte Laserstrahlen • Angenommen: Brechungsindex der Zelle nz> nu Umgebung • Somit nimmt der Lichtimpuls in der Zelle zu und auf Grund der Impulserhaltung erhält die erste Oberfläche der Zelle einen Impuls/Kraft nach hinten (=außen), die zweite nach vorne (=außen). Es sollte natürlich weniger reflektiert und absorbiert werden als hindurch geht.

35. Prinzip des Testgeräts • Damit keine Gesamtkraft auf die Zelle wirkt haben wir zwei entgegengerichtete gleiche Laser

36. Möglichkeiten dieses Tests • Diagnose und Einstufung des Tumors anhand von nur 50 Zellen möglich • Vorhersage möglich, ob der Tumor Metastasen bildet / gebildet hat • Z.B. präventive Brustentfernungen vermeidbar • 3600 Zellen / min • Auch als Vorsorgeuntersuchung routinemäßig z.B. beim Zahnarzt gegen Mundkrebs einsetzbar

37. Quellen • Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 4th ed. • Prof. Rief, Vorlesungsskript: „Einführung in die Biophysik 2“ • Lodish, Molecular Cell Biology 5th ed. • Prof. Bausch, „A Bottom-up approach to cell mechanics“, Nature Vol. 2/06 • J. Crocker, „Two-Point Microrheology of Inhomogenous Soft Materials“, Physical Review Letters Vol. 85/00 • Paul A. Janmey, David A. Weitz, „Dealing with mechanics: mechanisms af force transduction in cells“ Review TRENDS in Biochemical Sciences Vol. 29 No.7 July 2004 • http://www.uni-leipzig.de/%7Epwm/kas/cytoskeleton/Cytoskeleton.html • http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/cytoskeleton.html • http://kumarlab.berkeley.edu/biophysics.html • http://www.biochemweb.org/cytoskeleton.shtml • http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/Cytologie/cysk-fkt/cysk01.html • http://www.people.fas.harvard.edu/~jiayuliu/actinlength/actinlength.htm • http://www.deas.harvard.edu/projects/weitzlab/papers/PRL01250.pdf • http://www.uni-leipzig.de/~pwm/kas/motility/migration.html • http://www.uni-leipzig.de/~pwm/kas/mechsensing.html • http://www.innovations-report.com/html...ts/physics_astronomy/report-42905.html • http://biophysj.org/cgi/full/81/2/767 • http://biop.dk/Research/Tweezers.htm