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Immunologisches Labor

Immunologisches Labor. Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV. 1. Facharztweiterbildung Nuklearmedizin. Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in ...

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Immunologisches Labor

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  1. Immunologisches Labor Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV 1

  2. Facharztweiterbildung Nuklearmedizin • Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in ... … der nuklearmedizinischen in-vivo- und in-vitro-Diagnostik unter Verwendung von organ-/zielgerichteten Radiodiagnostika … … der Radiochemie und der gebietsbezogenen Immunologie und Radiopharmakologie 2

  3. Juristische Voraussetzungen • Laborrichtlinien KBV 5/1994 Nuklearmediziner : RIA (entspr. Weiterbildung/Zeugnis) Bei NON-RIA : Prüfung Fachkommission • Schriftwechsel KBV 2005 Immunologische Parameter unabhängig von Methode ( RIA , LIA , FIA etc ) durch Nuklearmediziner abzurechnen , falls Weiterbildung vorliegt 3

  4. Fachliche Aspekte • Laborkolloquium von der KV eingesetztes Gremium 3-4 Mitglieder ( mind. 1 Laborarzt ) • Fragenkatalog Angaben von Kollegen 4

  5. Immunologische Methoden RIA, LIA, FIA Immunologisches Testprinzip Interpretation der Ergebnisse Rili-BÄK Qualitätsmanagement Qualitätssicherung Inhalt Kolloquium

  6. 41. Jahrestagung des BDN Immunologische Messmethoden Nürnberg, September 2012 In Kooperation mit: Euro-Labor-Freiburg Dr. Hermann Butz, Drei-G-Consulting 6

  7. Empfohlene Literatur Sokolowski/Wood: Radioimmunoassay in Theorie und Praxis: nur noch antiquarisch erhältlich L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage, gebraucht ca. 100 € bei Amazon, Kapitel 52.1: Immunchemische Techniken (S. 1915 – 1936) Packungsbeilagen der jeweiligen Teste Ausführlicheres Vortragsscript: Euro-Labor Freiburg schwabe@euro-labor-freiburg.de oder hermann.butz@drei-g-consulting.de 7

  8. Klassisches Anwendungsgebiet von Immunoassays: Hormonanalytik Hormonanalytik von Körperflüssigkeiten (in-vitro, ohne Probenaufbereitung) Spezifischer Nachweis von Hormonkonzentrationen in Anwesenheit vieler anderer, zum Teil sehr ähnlicher Moleküle:  hohe Spezifität gefordert  Schlüssel-Schloss-Prinzip von Antigen-Antikörper-Reaktionen Nachweis extrem niedriger Konzentrationen (10-6 bis 10-16 mol):  hohe Signalstärke gefordert = hohe „spezifische Aktivität“ des Signalträgers gefordert 125J (später weitere Signalträger: Enzyme, Fluoreszenz, Luminesz.) • Erster Immunoassay: R. Yalow/S. Berson (1959): Nobelpreis 1977 Insulin-RIA, (kompetitiver IA, homogen) • Heutiger Standard-IA: Sandwich-Immunoassay (nicht-kompetitiver IA, heterogen) 8

  9. „Teilnehmer“ eines Immunoassay Antigene (Analyte = zu bestimmende Substanz): Hormone (Proteohormone, Steroidhormone,...), Medikamente, .... Antikörper: Y-Form mit Fab-Teil (Antigenspezifisch) und Fc-Teil (Speziesspezifisch), bindet spezifisch an „Ziel“-Antigene Antigene und Antikörper bilden Ag-Ak-Komplexe nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip Ag-Ak-“Reaktionen“ folgen dem Massenwirkungsgesetz (Ag-Ak) Ag + Ak  Ag-Ak Affinitätskonstante K = ------------------- (Ag) x (Ak) hohe Affinitätskonstante = feste Bindung von Ag und Ak  Hohe Analytische Sensitivität möglich 9

  10. Bestandteile eines (Sandwich-)Immunoassays Gesucht: variable Konzentration eines Ag Messbar über: • konstante Zahl von Ak im Immunoassay • Markierung des Ak  AkÜberschuss • Komplexbildung: Ag + AkÜberschuss Ag-Ak + Ak • Trennung von gebundener Phase Ag-Ak und freier Phase Ak  gesuchte Antigenkonzentration = Menge des Signals in der gebundenen Phase = Ag-Ak 10

  11. Wash Moderne, heterogene IA: Vorwegnahme der Trennung von freier und gebundener Phase durch Kopplung eines Ak an eine Festphase Gebundene Phase Freie Phase Festphase (Solid Phase): • Röhrchenwand • Kaverne einer Mikrotiterplatte • Kügelchen • Magnetische Partikel, Latex-Partikel, Glas-Partikel,.... • Je kleiner und „beweglicher“ die Festphase, umso kürzer die Inkubationszeit 11

  12. Wash Markierung eines Ak mit geeignetem Signalträger Signalgeber (Tracer): • Radioaktivität (125J, 3H: Gammacounter; 1-10 Minuten) • Enzyme (farblose Substrate  farbige Produkte: Photometer (Lambert-Beer‘sches Gesetz; 10-20 Min.)) • Lumineszenz (Acridiniumester, Luminol, (Enzym: Alkalische Phosphatase katalysiert Lichtreaktion): Luminometer; 1- 60 sec.) • Fluoreszenz (Fluorophore: Fluorometer; 1 sec.) 12

  13. _ 125J _ _ _ Signalarten RIA, IRMA, Gammacounter Wash EIA, IEMA Farblose Substrate Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) E 10 – 20 Minuten (MPO) Farbige Produkte LIA, ILMA Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott H2O2 + NaOH AE AE‘ + Licht (1-2 sec.) LIA, ILMA Elektro-CL: Roche Anregende Elektrode TR Licht MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium 13

  14. _ 125J _ _ _ Signalarten Keine der verschiedenen Signalarten (125J, Enzym, Fluorophor, Luminophor) ist in der Summe aller Eigenschaften der anderen eindeutig überlegen RIA, IRMA, Gammacounter Wash EIA, IEMA Farblose Substrate Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) E 10 – 20 Minuten (MPO) Farbige Produkte LIA, ILMA Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott H2O2 + NaOH AE AE‘ + Licht (1-2 sec.) LIA, ILMA Elektro-CL: Roche Anregende Elektrode TR Licht MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium 14

  15. EIA oder LIA oder FIA vs. RIA Was unterscheidet einen RIA von den anderen IA NUR die Signalart, sonst ist alles gleich !!! Wer eine RIA abarbeiten und die Ergebnisse im klinischen Kontext bewerten kann, der kann auch mit nicht-Radioaktiven IA korrekt umgehen. Welche konstruktiven Varianten von IA (RIA, EIA, LIA, FIA) gibt es ? Nicht-Kompetitive IA vs. Kompetitive IA = IRMA vs. RIA 15

  16. Wash Bestandteile eines IA, Ablauf „Standard“-Sandwich-Immunoassay: IRMA (Immun-RadioMetrischer Assay) • Ak1 an Festphase • Ak2 mit Signalträger (125J, andere Signalträger: analog) • Inkubation mit Probenantigenen • Waschschritt • Messung 16

  17. Y Darstellung der Ag-Ak-Komplexe Bisherige Darstellung Y Vereinfachte Darstellung 17

  18. Wash Y Relatives Signal Y Y Y ............. ............. 6 5 4 3 2 1 0 Y Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Signal-AK2 im Überschuss 18

  19. Wash Y Relatives Signal Y Y Y ............. ............. 6 5 4 3 2 1 0 Y Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Analyt im Unterschuss Signal-AK2 im Überschuss 19

  20. Wash Y Relatives Signal Y Y Y ............. 6 5 4 3 2 1 0 Y Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung ............. Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Analyt im Unterschuss Signal-AK2 im Überschuss 20

  21. Wash Y Relatives Signal Y Y Y ............. 6 5 4 3 2 1 0 Y 0 1 2 3 4 5 6 Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Maximales Signal ............. ............. Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) SP-AK1 Analyt Signal-AK2 21

  22. Wash Y Relatives Signal Y Y Y ............. 6 5 4 3 2 1 0 Y 0 1 2 3 4 Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Störung eines IRMA: High-Dose-Hook-Effekt Bei extremen Analytkonzentrationen (z.B. hCG bei Blasenmole) steigt die Zahl von „einzelnen“ AK-Ag-Komplexen (vgl. Heidelberger Kurve) = eine steigende Anzahl von Ag-Signal-Ak-Komplexen wird weggewaschen. Das Mess-Signal (SP-AK1-Ag-Signal-Ak2) sinkt trotz steigender Analytkonzentration. Ein Signal (hier: relatives Signal „3“) kann zu mehreren Konzentrationen gehören (relative Konzentration „3“ oder zu einer extrem hohen Konzentration x). Hilfe: Wash nach SP-Ak1-Ag-Inkubation oder Verdünnungen herstellen und vermessen Maximales Signal ............. ............. ............. .. .. x SP-AK1 im Unterschuss Analyt im hohen Überschuss Signal-AK2 im Unterschuss 22

  23. Solid Phase Sandwich-Technik für alle Antigene geeignet ?  NEIN !!! Bestimmung von Steroiden oder Schilddrüsenhormonen ? Östradiol: MG 272,3 Da T4: MG 776,9 Da Sehr kleine Analyte haben nur 1 Epitop,  Bindung eines zweiten (Signal-) Antikörpers an den Analyten ist nicht möglich  andere Assaytechnik ist gefordert  Markierung des Antigens (Assay-Ag: Ag )  kompetitive Immunoassays 23

  24. Gesucht: Konzentration des Analyten in der Probe via Ag Y Y Y Y SP-AK Kompetitive Immunoassays:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Prinzip: Proben-Antigen und markiertes Assay-Antigen konkurrieren um die Bindungsplätze am Antikörper und belegen sie entsprechend ihrer Konzentrationsverhältnisse. Das Messsignal ist am höchsten, wenn kein Probenantigen vorhanden ist. Mit steigender Anzahl von Probenantigen werden immer mehr markierte Assay-Antigene verdrängt und das Messignal sinkt:  Konzentrationsbestimmung möglich! 24

  25. Relatives Signal Y Y Y Y 6 5 4 3 2 1 0 Relative Konzentration: Standards (Analyt) SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung SP-AK 0 1 2 3 4 5 6 25

  26. Relatives Signal Y Wash Y Y Y 6 5 4 3 2 1 0 Relative Konzentration: Standards (Analyt) SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung SP-AK 0 1 2 3 4 5 6 26

  27. Ag-Probe Ag-Assay Relatives Signal Y Y Y Y 6 5 4 3 2 1 0 Relative Konzentration: Standards (Analyt) SP-AK im Unterschuss Analyt in der Probe Markierter Analyt im Überschuss Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 0 1 2 3 4 5 6 27

  28. Relatives Signal Y Wash Y Y Y 6 5 4 3 2 1 0 Relative Konzentration: Standards (Analyt) Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK im Unterschuss Analyt in der Probe Markierter Analyt im Überschuss 28

  29. Relatives Signal Wash Y Y Y Y 6 5 4 3 2 1 0 Flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) 0 1 2 3 4 5 6 Relative Konzentration: Standards (Analyt) Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) Konzentrationsverhältnis: 18 : 6 = 3 : 1 SP-AK im Unterschuss Analyt in der Probe Markierter Analyt im Überschuss 29

  30. Relatives Signal Relatives Signal 6 5 4 3 2 1 0 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 Relative Konzentration: Standards (Analyt) Relative Konzentration: Standards (Analyt) Sandwich-IA vs. kompetitiver IA = IRMA vs. RIA IRMA: • Relative untere Nachweisgrenze: 1 • Linear und steil ansteigende Standardkurve (= sehr gute Präzision) • Breiter Messbereich (Ak1,2-Erhöhung) mit sehr guter Präzision RIA: • Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) • flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) • eingeschränkter Messbereich mit akzeptabler Präzision 30

  31. Zusammenfassung: Ist der Analyt groß genug: Nicht-Kompetitiv = IRMA Ist der Analyt ein Hapten: Kompetitiv = RIA • Gute Sensitivität • Gute Präzision • Weiter Messbereich • Gute Spezifität • Schnell • Sehr gute Sensitivität • Sehr gute Präzision • Sehr weiter Messbereich • Sehr gute Spezifität • Sehr schnell Verschiedene (+/- gleichwertige) Signalarten RIA‘s unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA 31

  32. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit ! 32

  33. Rili-BÄK Aktuell = 4. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (gültig seit 15.02.2008) • Sie gilt für jeden, der analytische Messungen durchführt und stellt eine Vielzahl komplexer Anforderungen an das Management und das Personal in Laboren und Praxen! Der heutige Fokus liegt auf Teil A und Teil B1 der Rili-BÄK: • Teil A betrifft die grundlegenden Anforderungen an die Qualitätssicherung • Teil B1 die QS quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen 33

  34. Rili-BÄK • Teil Ader Richtlinie fordert die Erstellung eines umfassendenQualitätsmanagement-Systemszur Regelung der folgenden Bereiche: • Struktur (Organigramm, Zuständigkeiten…) • Technische- und Personelle Ressourcen (Räume, Ausrüstung…) • Präanalytik (Gewinnung, Transport, Vorbereitung Probenmaterial…) • Analytik (Standardisierte Arbeitsanleitungen, Validierte Untersuchungsverfahren…) • Postanalytik (technische und medizinische Validation, Laborbericht…) • Qualitätsmanagementhandbuch (QM-Ziele & Strategien, Arbeitsprozesse…) • Dokumentenlenkung (Versions-Nr., Freigabe, Schulung…) • Umgang mit Beschwerden (Dokumentation, Korrekturmaßnahmen…) • Fremdlaboratorien (Versanddokumentation, Kontrolle…) • Fehlerhaften Untersuchungsergebnisse (Verfahrensbeschreibung…) 34

  35. Rili-BÄK • Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interneundexterne QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a 35

  36. Rili-BÄK • Interne QS: alle vom medizinischen Laboratorium durchgeführten quantitativen Untersuchungen unterliegen der internen Qualitätskontrolle 36

  37. Rili-BÄK • Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interneundexterne QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a 37

  38. Rili-BÄK • Konsequenz bei nicht Einhaltung der zulässigen relativen Abweichung Überschreitet ein Kontrollprobeneinzelmesswert die vorgegebene Fehlergrenze, ist das Messverfahren vorläufig gesperrt; es muss nach der Ursache der Abweichung gesucht und diese beseitigt werden; die Messung wird wiederholt. Überschreitet der relative quadratischen Mittelwert der Messabweichung (QMDM) einer Kontrollprobe, den in Tabelle B1a-c/Sp3 angegebenen oder den laborintern ermittelten Wert, ist das Untersuchungsverfahren für weitere Messungen von Patientenproben zu sperren. Das Messverfahren kann erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Funktionsfähigkeit des Verfahrens durch geeignete Maßnahmen festgestellt wurde. Alle QS- Maßnahmen müssen lückenlos dokumentiert werden. 38

  39. Rili-BÄK • Externe Qualitätssicherung (Ringversuche) Für alle durchgeführten Analysen, der in Tabelle B1 a-c aufgeführten Parameter, ist die Teilnahme an einem Ringversuch pro Quartal Pflicht. Die vollständige Richtlinie (incl. Tabelle B1a bis c) erhalten Sie auf der Homepage der Bundesärztekammer unter www.bundesaerztekammer.de Für weitere Informationen und/oder die Zusendung des Scripts können Sie gerne Frau Regina Clotten (QMB euro-labor) unter der E-Mail Adresse: clotten@euro-labor-freiburg.de kontaktieren. 39

  40. Kooperations-Möglichkeiten Kostenbetrachtung Reduzierung der Vergütung für SD-Parameter (GKV-EBM) 2000 und 2006 um je 30-60 !!! „Herstellungskosten“ für Immunologische Parameter konstant / steigend (Personal, Geräte, Miete...) Rili-BÄK – Zusätzliche Kosten!!! Teil A: Qualitätsmanagemant (Handbuch etc.) Teil B: Interne + Externe Qualitätskontrollen z.B. 15-20 SD-Patienten/Tag >> 20 – 30.000,- € Kosten/Jahr 40

  41. Kooperations-Möglichkeiten Optimale Teste für SD-Parameter (unabh. Von Methode, Preis etc.) > Eigenständiges Immunologisches Labor > Mehrere Analysegeräte für unterschiedliche SD-Parameter > Auswahl nach aktueller Qualität (Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Ablauf etc.) > Kontroll-Möglichkeiten für jeden einzelnen einsendenden Arzt Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t 41

  42. Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung I Ärztlich Untersuchungsentscheidung (Indikation) II Präanalytik III Laboratoriumsmedizinische Analyse IV ärztliche Beurteilung 42

  43. Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Immunologische Laboratorium-Untersuchung in eigener Praxis Indikationsstellung, Präanalytik (Schritt I+II) Qualitätsprüfung (Korrelation mit anderen Parametern, Verlauf, Therapiebeeinflußung etc.) Befundung (Schritt IV) 43

  44. Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Immunologische Laboratorium-Untersuchung „im ausgelagertem Labor“ Technische Leistung (Schritt III) = Laboratoriumsmedizinische Analyse (zentral erbracht) 44

  45. Kooperations-Möglichkeiten Eigenständiges Abrechnen Modell „Immunologie Freiburg“ Erste von der KV genehmigte überörtliche Leistungserbringergemeinschaft zur Erbringung immunologischer Untersuchungen in Deutschland Schritte I, II, IV in eigener Praxis Schritt III in Rahmen „Immunologie Freiburg“ 45

  46. Kooperations-Möglichkeiten eigenständiges Abrechnen Systematik des §15 Abs. 3 BMW-Ä: Die Leistung wird als eigene Leistung desjenigen Arztes abgerechnet, wenn Schritt 1, 2, 4 in eigener Praxis und Schritt 3 in Rahmen der Leistungserbringergemeinschaft „Immunologie Freiburg“ im Auftrag des Arztes durch einen anderen erbracht wird. Mitgliedschaft in „Immunologie Freiburg“ bedeutet eigenständige Leistungserbringung! 46

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