ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ – перераспределение материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых комбинаций генов или других нуклеотидных последовательностей. Отдельное место занимает рекомбинация на уровне РНК у некоторых РНК-содержащих вирусов (пикорнавирусы, коронавирусы). Р между молекулами ДНК представляет широкий набор различных по генетическому контролю и молекулярным механизмам. В отличие от других генетических процессов (репликация, репарация и др.), для рекомбинации необходим физический контакт между рекомбинирующими участками ДНК – СИНАПСИС. Исходя из молекулярных механизмов, генетического контроля и природы синапсиса, все известные рекомбинационные процессы можно подразделить на следующие типы:

3. ГОМОЛОГИЧНАЯ или ОБЩАЯ Р, или КРОССИНГОВЕР Здесь синапсис основан на спаривании цепей ДНК с комплементарными основаниями, для чего необходимо наличие протяженной гомологии между рекомбинирующими последовательностями. Чтобы обнажить комплементарные одноцепочечные (однонитевые) участки для синапсиса, необходимы разрывы и определенная деградация цепей ДНК. Процессы гомологичной Р осуществляют большие группы специальных белков. Из общей Р следует выделить ЭКТОПИЧЕСКУЮ Р. По существу, она является неаллельной. Эктопическая Р заключается кроссинговерах между отдельными повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что приводит к различным хромосомным перестройкам. По генетическому контролю, молекулярному механизму и природе синапсиса эктопическая Р относится к гомологичной.

4. Остальные типы рекомбинации не нуждаются в гомологии. Природа синапсиса у них принципиально иная: специальные белки узнают определенные последовательности ДНК и связываются с ними; образовавшийся ДНК-белковый комплекс входит в контакт (синпсис) с негомологичным дуплексом ДНК и осуществляет между ними обмены цепями. Типы негомологичной рекомбинации: САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ происходит между определенными нуклеотидами, находящимися в специальных рекомбинационных сайтах. Широко распространена у вирусов и бактерий, единственный известный случай у эукариот – 2µ-плазмида у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ключевыми ферментамисайт-специфической рекомбинации всегда являются сайт-специфические тороизомеразы типа I. Поэтому рекомбинация является консервативной, то есть осуществляется без каких-либо фиксированных повреждений или деградации ДНК и не нуждается в источниках энергии типа АТР.

5. ТРАНСПОЗИЦИИ – обширная группа рекомбинационных процессов, осуществляющих перемещения особых МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ из одного участка генома в другой. НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ. К ней относят рекомбинационные процессы между негомологичными ДНК, осуществляющиеся помимо сайт-специфической рекомбинации и транспозиций. У бактерий известен механизм обмена между негомологичными ДНК с использованием ДНК-гиразы, у эукариот основным является процесс соединения концов негомологичных дуплексов ДНК – non-homologous DNA end-joining (NHEJ).

6. ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

7. Эктопическая рекомбинация Эктопическая рекомбинация – частный случай гомологичной рекомбинации. Она осуществляется между повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что может приводить к разнообразным хромосомным перестройкам.

8. Тип возникающей перестройки зависит от ориентации повторяющихся последовательностей ДНК (прямая или обратная) и от их локализации (в одной хромосоме, в сестринских хроматидах, в гомологичных или в разных хромосомах). Рассмотрим два примера эктопической рекомбинации в случае прямых повторов ДНК.

10. Молекулярные механизмы гомологичной рекомбинации Модель Холлидея,1964 г.

11. Модель Холлидея была разработана автором для объяснения явления генной конверсии а также некоторых закономерностей, связывающие ее с кроссинговером. Холлидей развивал свою модель в то время, когда изучение молекулярных механизмов кроссинговера только начиналось. Конверсия представляет собой нереципрокную гомологичную рекомбинацию, приводящую к нарушению менделевского расщепления аллелей 2:2 среди продуктов мейоза. Для выявления конверсии обычно используют метод тетрадного анализа у грибов-аскомицетов или базидиомицетов. В тетрадном анализе конверсия проявляется в виде тетрад с необычным соотношением аллелей в аскоспорах 3А:1а или 1а:3А, реже 3А:5а или 3а:5А, еще реже 4А:0а или 0А:4а. Слово конверсия означает превращение одного аллеля в другой.

12. Холлидей правильно предположил, что в основе этого явления лежит репарация (коррекция) неспаренных нуклеотидов в рекомбинационном гетеродуплексе (ГД). ГД – участок дуплекса ДНК, состоящий из цепей от разных родительских молекул, является важнейшим интермедиатом рекомбинационного процесса. Если в ГД попадают разные аллели гена, то возникающее локальное неспаривание оснований узнается специальными репарационными ферментами и подвергается репарации, где одно из неспаренных оснований удаляется вместе с окружающими нуклеотидами, а возникшая брешь застраивается по матрице комплементарной нити. Впоследствии такая репарация была продемонстрирована у E.coli и у эукариот под названием Mismatch Repair (MMR) – репарация неспаренных оснований. Основное назначение MMR – исправление ошибок, допускаемых ДНК-полимеразами в процессе репликации ДНК. Тот же механизм используется и для коррекции неспаренных оснований в рекомбинационных ГД. Это приводит к нарушению реципрокности рекомбинации в участке кроссинговера.

13. Упрощенная схема репарации неспаренных оснований ДНК (missmatch repair - MMR) Mlh1, Pms1, Msh2, Msh3, Msh6 Репаративный синтез ДНК (ДНК-полимераза d)

15. Генетические данные, полученные Фогелем, Мортимером и другими исследователями на дрожжах и других аскомицетах, свидетельствовали, что в мейотической рекомбинации конверсия может сопровождаться кроссинговером по внешним (фланговым) маркерам, а может не сопровождаться, причем эти события обычно равновероятны. Эти факты также легли в основу модели Холлидея. Отметим, при рекомбинации в соматических клетках конверсия, как правило, более чем в 90% случаев не сопровождается кроссинговером («конверсия без кроссинговера»). Этот факт объясняется опасностью возможных эктопических кроссинговеров, приводящих к хромосомным перестройкам. В то же время конверсия необходима для осуществления многих важных онтогенетических процессов. Но возвратимся к модели Холлидея.

16. Модель Холлидея основана на нескольких допущениях. 1. В двух гомологичных дуплексах ДНК, у эукариот соответствующих хроматидам, возникают первичные разрывы. 2. Разрывы вводятся в нити одинаковой полярности. 3. Первичные разрывы возникают в специфических сайтах, которые Холлидей называл рекомбинаторами. Гипотеза о существовании особых последовательностей ДНК («горячих точек» рекомбинации), в которых инициируется кроссинговер, разделялась многими генетиками, а к настоящему времени получила многочисленные экспериментальные подтверждения. 4. Затем от мест первичных разрывов происходит обмен цепями ДНК, приводящий к образованию структуры, получившей впоследствии название структуры Холлидея (Holliday junction или Holliday structure). 5. Затем должно произойти разрешение полухиазмы с помощью вторичных разрывов ДНК. Холлидей постулировал два типа вторичных разрывов. Разрывы 1-го типа возникают в обмениваемых нитях, в точке их перекрёста и приводят к образованию некроссоверных структур с внутренним ГД. Разрывы 2-го типа вводятся в 2 другие нити ДНК напротив точки перекрёста, что сопровождается формированием кроссоверных, также содержащих ГД в участке переброски цепей ДНК. Поскольку вторичные разрывы обоих типов, по Холлидею, равновероятны, а коррекция ГД есть конверсия, то одинакова и вероятность событий конверсии с кроссинговером и без него, что стремился объяснить Холлидей.

17. Модель Холлидея (Holliday, 1964)

18. Позднее, уже другими исследователями, модель Холлидея была дополнена двумя явлениями. 1. Миграция ветвления (branch migration) или миграция структуры Холлидея, в ходе которой точка перекреста нитей должна сместиться. Миграция структуры Холлидея должна сопровождаться вращением обоих дуплексов ДНК. Этот процесс необходим для формирования и удлинения ГД. 2. Изомеризация структуры Холлидея. Она в изменении структуры полухиазмы за счёт поворотов двух дуплексных сегментов («плеч») вокруг точки перекрёста на 180º (два других «плеча» не сдвигаются) за счёт теплового движения молекул. Структуры В и В’ на рисунке идентичны. Структура В’ представляет изображение В в крестообразном виде, что несколько приближает её к виду реальной полухиазмы. Такая структура подвергается разрешению путем введения вторичных разрывов, представляющих собой координированные разрывы двух цепей одинаковой полярности.

19. Электронно-микроскопическая фотография структур Холлидея

20. Важным достоинством модели Холлидея в является то обстоятельство, что с ней хорошо согласуются как генетические данные, так и результаты молекулярно-биологических исследований механизмов рекомбинации. Как уже отмечалось, крестообразные структуры Холлидея наблюдаются на электронно-микроскопических фотографиях ДНК из клеток разных организмов. Главное, что и у про- и у эукариотических организмов идентифицированы белки, осуществляющие все этапы, составляющие модель Холлидея. Известны эндонуклеазы, катализирующие первичные разрывы цепей ДНК, например, эндонуклеаза Spo11, иницирующая мейотическую рекомбинацию у дрожжей. Обмен цепями между гомологичными молекулами ДНК проводи белок RecA E.coli и его эукариотические гомологи. Реакцию миграции структуры Холлидея проводят специальные ДНК-хеликазы или хеликазо-подобные белки RuvA-RuvB или RecG у E.coliи Rad54, Rdh54, BLM и др. у эукариот. Эндонуклеаза, осуществляющая вторичные разрывы (резолваза) была впервые описана у фага T4 (продукт гена 49), затем у фага T7, дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а позднее и в клетках человека (культура клеток HeLa).

21. В последующие десятилетия модель Холлидея получила дальнейшие развитие. Представленные в ней процессы легли в основу современных молекулярных моделей гомологичной рекомбинации, прежде всего, схем путей рекомбинационной репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Далее мы охарактеризуем основные рекомбинационные белки а также их вспомогательные белки.

22. RecA – ГЛАВНЫЙ БЕЛОК гомологичной рекомбинации уE.coli. Мономер белка имеет размер около 37,8 kDa. В таком виде он неактивен. Для активации необходимы АТФ и ОН ДНК, представленная в любом виде: хвост, брешь, фрагментили даже олигодезоксинуклеотид. В условиях in vitro мономеры белка RecA в присутствии АТФ кооперативно связываются с ОН ДНК и формируют вокруг нее правозакрученную белковую спираль (не путать с правозакрученной спиралью ДНК). Эта вытянутая по длине структура получила название «RecA-ДНК-филамент» или «пресинаптическая структура». В первых этапах формирования филамента участвует белок SSB, который распрямляет цепь ДНК и позволяет белку RecA строить филамент, но затем SSB вытесняется белком RecA. В условиях in vivoв сборке филамента участвуют и другие дополнительные белки. Сборка филамента происходит в направлении 5’-3’ относительно цепи ДНК, вокруг которой он строится. В филаменте RecA связан с ДНК в стойхиометрическом соотношении 1 мономер белка на 3 н. и 6,2 мономера на виток. Цепь ДНК располагается вдоль внутренней оси филамента. Если ОН ДНК находится в составе двунитевой (ДН) ДНК (ОН хвост или брешь), то формирующийся на ней филамент может перейти на дуплекс. Внутри филамента ДН ДНК вытянута в 1,5 раза по сравнению с В-формой ДНК.

23. Формирование RecA-ДНК-филамента и инициация рекомбинации

24. RecA-филамент(вид сбоку). По (по P.R. Bianco andS.C. Kowalczykowski, Encyclopedia of life sciences, 2001, с изменениями). ДНК невидна. Показаны мономеры RecA в филаменте. Одна сторона мономера относительно гладкая, на другой отчетливо выступают 3 доли. В филаменте хорошо различим большой спиральный желоб. Соответственно конформации мономера RecA,одна сторона жолоба гладкая, другая, с выступающими долями, шероховатая. Желоб является сайтом связывания с LexA и другими эффекторными белками и с ДН ДНК.

25. RecA-ДНК-филамент представляет АКТИВИРОВАННУЮ форму белка RecA. Активную форму белка RecA в составе RecA-ДНК-филамента принято обозначать как RecA*. Белок RecA E.coli полифункционален. Его активированная форма – RecA* играет ключевую роль в осуществлении трех совершенно различных процессов: 1. РЕКОМБИНАЦИЯ (синапсис и обмен цепями ДНК) происходит внутри филамента. Для рекомбинации необходимо, чтобы одна ДНК уже была в составе филамента, а другая должна быть «голой».

26. Функции белка RecA*

27. 2. МУТАГЕННАЯ SOS-РЕПАРАЦИЯ. Здесь имеет место следующая последовательность событий: Нерепарированное к моменту репликации повреждение ДНК приводит к задержке машины репликации перед повреждением, то есть к появлению участка ОН ДНК и, соответственно, формированию на ней RecA-ДНК-филамента – RecA*. RecA* проявляет свойство копротеазы, которая стимулирует белок-репрессор LexA к аутопротеолитическому расщеплению молекулы LexA на две части. Под контролем LexA находятся около 30 генов, контролирующих так называемые SOS-функции, в том числе гены, кодирующие белки UmuC и UmuD. В результате инактивации репрессора LexA происходит индукция синтеза Umu-белков. При этом нативный белок UmuD под воздействием RecA* подвергается автопротеолитическому UmuD отщеплению от него небольшого N-концевого фрагмента, что превращает его в активную форму UmuD’.

28. SOS-репарация 5’ 3’ 5’ ДНК-пол.III О- Некомплементарный нуклеотид 5’ 3’ 5’ SOS-индукция ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) О Ошибки UmuC 5’ 3’ TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG UmuD’ 3’ 5’ RecA-ATP

29. Белки Umu образуют комплекс Umu(D’)2C, ролучивший название ДНК-полимераза V (Pol V). Pol V оказывается в районе повреждения ДНК, где был сформирован RecA-ДНК-филамент, и перед которыми «застряла» ДНК-полимераза III. Затем к свободной Pol V происходит перенос первого мономера RecA от 3’-конца филамента вместе с молекулой АТФ. В результате формируется активная форма PolV – Pol V Mut или мутасома, которая способна пройти через повреждение, вставляя напротив него произвольные нуклеотиды. Такой процесс обхода повреждения ДНК в вилке репликация называют translesion DNA synthesis – TLS. После этого комплекс ДНК-полимеразы V диссоциирует от ДНК, а ДНК-полимераза III, продолжает нормальную репликацию ДНК. Приведенные данные объясняют, почему мутант recAнеспособен к УФ-индуцированному мутагенезу.

30. SOS-репарация 5’ 3’ 5’ ДНК-пол.III О- Некомплементарный нуклеотид 5’ 3’ 5’ SOS-индукция ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) О Ошибки UmuC 5’ 3’ TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG UmuD’ 3’ 5’ RecA-ATP

31. Миграция ветви осуществляется белками RuvA и RuvB • Белок RuvA связывает точку кроссинговера и затем фланкируется двумя гексамерными кольцами белка RuvB (с АТФазной активностью). Эти кольца лежат в противоположной ориентации и служат моторами, которые перемещают ДНК.

33. Реакция разрешения полухиазмы, катализируемая эндонуклеазой RuvC E.coli Рекомбинантная цепь Интактная цепь Сайт разрыва Сайт разрыва Димер RuvC

34. ОСНОВНЫЕ БЕЛКИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ Процесс гомологичной рекомбинации разделяют на 3 основные стадии: ПРЕСИНАПСИС – подготовка ДНК-субстрата к рекомбинации: введение разрывов, образование участка ОН ДНК, формирование на ОН ДНК RecA-ДНК-филамента. СИНАПСИС – нахождение гомологии и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК. ПОСТСИНАПСИС – миграция и разрешение структуры Холлидея. По этим стадиям принято распределять белки, осуществляющие рекомбинации.

35. Основные стадии рекомбинации, осуществляемой белком RecA (поP.R. Bianco andS.C. Kowalczykowski, Encyclopedia of life sciences, 2001, с изменениями)

38. Гены и белки гомологичной рекомбинации у E.coli

41. Биологическое значение гомологичной рекомбинации Лежит в основе репарации двуцепочечных разрывов хромосом - самого тяжелого типа повреждений ДНК, вызываемых ионизирующими излучениями или возникающих спонтанно. Вносит вклад в генетическую изменчивость, лежащую в основе эволюции. Необходима для правильного расхождения хромосом в мейозе и для самого мейоза. Участвует в поддержании генетической стабильности повторяющихся генов.

42. Биологическое значение гомологичной рекомбинации Эктопическая рекомбинация Вносит существенный вклад в возникновение перестроек хромосом. Является одним из основных источников дупликаций генов и других последовательностей ДНК – это один из процессов, лежащий в основе эволюции генетического материала. Участвует в регуляции экспрессии генов путем онтогенетических перестроек генетического материала.

43. РЕКОМБИНАЦИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ (ДНР) ДНК

44. ДВУНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ (ДНР) ДНК относятся к наиболее тяжелым и сложно репарируемым повреждениям ДНК. Наиболее эффективно ДНР ДНК индуцируют ионизирующие излучения. Выход разрывов в результате облучения составляет (0,5-1)х10-11 ДНР/Da/Gy для прокариотических клеток и около 2х10-11 ДНР/Da/Gy для эукариот. В зависимости от вида и условий облучения на 1 ДНР возникает от 7 до 60 однонитевых разрывов (ОНР) ДНК. Но именно ДНР вносят основной вклад в гибель клеток, перестройки хромосом и генетическую нестабильность. В клетках, в которых репарация ДНР не осуществляется, например, в гаплоидных G1-клетках дрожжей или вклетках, дефектных по репарации разрывов клетках бактерий, 1 ДНР является летальным событием. В диплоидных клетках дрожжей 1 нерепарированный разрыв обычно приводит к утрате несущей его хромосомы.

45. Хотя процессы возникновения и репарации ДНР ДНК, индуцированных ионизирующими излучениями, представляют большой теоретический и практический интерес, их биологическое значение невелико по сравнению с ролью тех же процессов, необходимых для функционирования клеток в нормальных условиях. ДНР регулярно возникают и в нормальных условиях в ходе ряда рекомбинационных процессов (инициация мейотической и, возможно, митотической рекомбинации, переключение локусов типа спаривания у гомоталличных дрожжей, перестройки в иммуноглобулиновых последовательностях ДНК при формировании генов, кодирующих антитела (иммуноглобулины) ирецепторы Т-лимфоцитов), а также в процессе репликации ДНК, когда аппарат репликации встречает в разрыв в одной из цепей ДНК в вилке репликации, что приводит к разрыву (коллапсу) всей вилки.

47. В клетках эукариот любая рекомбинация, кроме транспозиций, инициируется ДНР ДНК. Репарация ДНР осуществляется по рекомбинационному механизму, и поэтому называется рекомбинационной репарацией. И наоборот, эукариотическая рекомбинация по существу сводится к репарации ДНР ДНК.

48. У бактерий и низших эукариот репарация ДНР ДНК осуществляется почти полностью на основе гомологичной рекомбинации. У высших эукариот гомологичная рекомбинация является единственным механизмом, работающим в мейотических клетках. Однако, в соматических клетках доминирующим путем репарации ДНР ДНК является негомологичная рекомбинация – NHEJ. Гомологичная рекомбинация в соматических клетках происходит, в основном, на стадии репликации ДНК с участием сестринских хроматид, часто в поврежденных вилках репликации. Сначала рассмотрим пути репарации ДНР ДНК, основанные на гомологичной рекомбинации. Отметим, что эти пути включают стадию формирования структур Холлидея.

49. При рекомбинационной репарации ДНР ДНК происходит внедрение 3’-концов ДНК в гомологичный дуплекс с образованием D-петель. Также такие структуры называют joint-молекулами. Структура D-петли обеспечивает праймер (3’-конец внедрившейся цепи ДНК) для репаративной репликации ДНК, которая необходима для восстановления генетической информации, утраченной в сайте ДНР, и для последующего восстановления непрерывной структуры ДНК. Одновременно этот процесс обеспечивает и генную конверсию. Далее joint-молекулы вступают в 2 основных пути рекомбинационной репарации: double-strand break repair (DSBR) и synthesis-dependent strand annealing (SDSA). Путь DSBR включает формирование двойных структур Холлидея, которые далее разрешаются специфическими резолвазами с образованием продуктов с конверсией с кроссинговером и без кроссинговера. В пути SDSA после осуществления репаративной репликации ДНК происходит диссоциация joint-молекулы(D-петли), после чего следует воссоединение разорванных концов путем отжига (annealing) комплементарных цепей ДНК.

50. Модель рекомбинации репарации на основе репарации ДНР ДНК(double-strand break repair, DSBR) – путь с конверсией и с кроссинговером по фланговым маркерам(Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)