Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ Email: ptlacava@esalqp.br

1. Manipulação de Bactérias Endofíticas para o Controle Biológico da Xylella fastidiosa, Agente Causal da Clorose Variegada dos Citros Paulo Teixeira Lacava Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ Email: ptlacava@esalq.usp.br http://www.esalq.usp.br

2. Coloniza vasos do xilema e forma biofilme Reduz a produção e pode causar a morte das plantas Brasil perde cerda US$ 200 milhões por ano com a CVC !!! Clorose Variegada dos Citros (CVC) Bactéria Xylella fastidiosa

3. Estado de São Paulo Áreas com sintomas de CVC

4. Simtomas da CVC Fruto sadio Fruto afetado CVC

5. Desenvolvimento da Xylella fastidiosa em pomares de citros

6. Xylella fastidiosa subsp. pauca Microscopia eletrônica de varredura (MEV), de um corte transversal dos vasos xilemáticos de plantas sintomáticas

7. Acrogonia citrina Bucephalogonia xanthophis Dilobopterus costalimai Oncometopia facialis Insetos vetores da X. fastidiosa (CVC) (Homoptera, Cicadellidae, subfamily Cicadellinae)

10. Microrganismos Endofíticos • Petrini (1991): em pelo menos uma fase de seu ciclo de vida colonizam o interior de tecidos vegetais aéreos sem causar danos ao hospedeiro (exclui bactérias fixadoras de N2 e os fungos micorrízicos). • Hallmann et al. (1997): isolados de tecidos vegetais desinfectados superficialmente ou do interior destes e que não causam danos às plantas. • Azevedoet al. (2000): são microrganismos que residem dentro de tecidos de plantas sem causar doenças e sem produzir estruturas externas visíveis.

11. Planta hospedeira Centro de estoque de microrganismos Microrganismos epifíticos Microrganismos endofíticos Endófitos colonizam um nicho ecologicamente semelhante ao dos fitopatógenos

12. Aplicações dos Microrganismos Endofíticos • Controle biológico de patógenos • Promoção de crescimento • Maior resistência contra estresse • Produção de moléculas bioativas

13. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa • Araújo et al. (2001). Diversity of endophytic bacterial population and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology. 68:4906-4914. Bactérias endofíticas em folhas de citros • - Pantoea agglomerans • - Bacillus pumilus

14. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa • Araújo et al. (2002). Diversity of endophytic bacterial population and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology. 68:4906-4914. • Bactérias endofíticas em ramos de citros • - Pantoea agglomerans • - Methylobacterium spp. • - Curtobacterium flaccumfaciens

15. Incidência de bactérias endofíticas em ramos de C. sinensis. Araújo et al. 2002

16. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa • Lacava et al. (2004). Interaction Between Endophytic Bacteria from Citrus sinensis and Xylella fastidiosa, Causal Agent of Citrus Variegated Chlorosis. Letters in Applied Microbiology 39, 55–59. Curtobacterium Methylobacterium

17. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa • Lacava et al. (2004). Interaction Between Endophytic Bacteria from Citrus sinensis and Xylella fastidiosa, Causal Agent of Citrus Variegated Chlorosis. Letters in Applied Microbiology 39, 55–59. X. fastidiosa X. fastidiosa Methylobacterium sp. (endophytic bacterium)

18. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa Methylobacterium sp. • Interação com Xylella fastidiosa, estimula o crescimento sendo isolada principalmente de plantas afetadas pela CVC. Curtobacterium flaccumfaciens • Interação com Xylella fastidiosa retardando seu crescimento sendo isolada principalmente de plantas resistentes à CVC. • Xylella fastidiosa • Pode interagir com bactérias endofíticas de citros, sendo estimulada ou inibida por estas bactérias.

19. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa • Os sintomas da CVC podem ser alterados pelas interações entre bactérias endófitos e Xylella fastidiosa; • O balanço populacional entre Methylobacterium, Curtobacterium e Xylellapode influenciar os sintomas da CVC; • Estes resultados reforçam evidências de que esta seja uma abordagem promissora para o entendimento da CVC.

20. Interação Endófitos x Xylella fastidiosa

21. Endófitos podem atuar como agentes no controle biológico da CVC • Seleção de bactérias endofíticas para controle biológico da CVC; • Desenvolver um sistema modelo para estudar a interação entre bactérias endofíticas e X. fastidiosa; • O controle da CVC depende da localização das bactérias endofíticas no mesmo nicho que X. fastidiosa.

22. Catharanthus roseus (Madagaskar periwinkle) Monteiro, P.B., Reunaudin, J., Jagoueix-Eveillard, S., Ayres, A.J., Garnier, M., and Bové, J.M. 2001. Catharanthus roseus, an experimental host plant for the citrus strain of Xylella fastidiosa. Plant Dis. 85: 246–251.

24. A A BA Numbers of Flowers B PW: media; Csp: C. flaccunfaciens; Xf: X. fastidiosa; Xf/Csp: X. fastidiosa and C. flaccunfaciens Interaction between C. flaccunfaciens (endophytic bacteria) and X. fastidiosa inside of host plant (C. roseus). Different letters on bars show statistic difference by Tukey’s test at 5% of significance

25. A A BA B Height (centimeters) PW: media; Csp: C. flaccunfaciens; Xf: X. fastidiosa; Xf/Csp: X. fastidiosa and C. flaccunfaciens Interaction between C. flaccunfaciens (endophytic bacteria) and X. fastidiosa inside of host plant (C. roseus). Different letters on bars show statistic difference by Tukey’s test at 5% of significance

28. Controle Simbiótico Um novo conceito de transformação genética chamado paratransgênese tem sido proposto para a prevenção de transmissão de patógenos por inseto vetores (Beard et al., 2001; Rio et al., 2004); Paratransgênese nesse tipo de aplicação significa a alteração genética de microrganismos simbióticos que possam ser transmitidos via vetor. Esta estratégia de prevenção de doença vêem sendo chamada de controle simbiótico, como uma variação da chamada terapia simbiótica (Ahmed, 2003); A chave do controle simbiótico está em achar um microrganismos candidato que co-exista no mesmo nicho ou ecossistema onde reside o problema, isto é, para o agente controlador ter acesso ao patógeno e atuar no seu controle ou eliminação.

29. Paratransgênese: Doença de Chagas 1- Identificação de um simbionte R. prolixus Rhodococcus rhodnii 2. Transformação simbionte 3. Reintrodução GM simbionte GM R. rhodnii Fonte: slide J.L. Ramirez

36. Controle Biológico Clássico Controle Simbiótico Curtobacterium (bactéria endofítica de citros) Methylobacterium (bactéria endofítica de citros) Methylobacterium coloniza tecido de planta e inseto vetor (Andreote et al, 2006 and Gai, 2006) Curtobacterium inibiin vitro Xf(Lacava et al, 2004) Testado em planta modelo (Lacava et al, 2007) Transformação de Methylobacterium (GFP) Próximos passos: produção de anti-Xylella efeitos Próximos passos: testar em campo e em plantas de citros Estratégias para controle da CVC utilizando endófitos

37. Agradecimentos • Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ; • Profa. Dra. Aline Ap. Pizzirani-Kleinner, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ; • Prof. Dr. Welington L. de Araújo, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ; • Profa. Dra. Sui Mui Tsai, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, CENA/USP; • Dr. Jonh S. Hartung, USDA-BARC, Beltsville, MD, USA • Prof. Dr. Thomas A. Miller, University of California Riverside, Riverside, CA, USA • Prof. Dr. João Roberto Spotti Lopes, Universidade de São Paulo/ESALQ • Dr Cláudia Santos Gai, INRA/CNRS, Castante – Tolosan, France

38. OBRIGADO !!! E-mail:ptlacava@esalq.usp.br