1 / 46

Loeng 4 Aminohapped ja valgud

Loeng 4 Aminohapped ja valgud. Aminohapete nomenklatuur , struktuur ja keemilised omadused Peptiidside . Pol üpeptiidid ja valgud Valkude funktsionaalne mitmekesisus Globulaarsed ja fibrillaarsed valgud Valkude struktuurse organisatsiooni tasemed Valkude primaarstruktuur Valkude puhastamine.

anoush
Download Presentation

Loeng 4 Aminohapped ja valgud

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Loeng 4Aminohapped ja valgud

  2. Aminohapete nomenklatuur, struktuur ja keemilised omadused • Peptiidside. Polüpeptiidid ja valgud • Valkude funktsionaalne mitmekesisus • Globulaarsed ja fibrillaarsed valgud • Valkude struktuurse organisatsiooni tasemed • Valkude primaarstruktuur • Valkude puhastamine

  3. Aminohapped • Valgud koosnevad aminohapetest • 20 aminohapet on harilikud ehk standardsed • Aminohapped va proliin on a -aminohapped a-süsinik H R-C-COOH NH2 a-aminohape üldkujul

  4. Aminohapped kui tsvitterioonid Neutraalse pH juures on laenguga nii amino- kui ka karboksüülrühm st molekulid on bipolaarsed ioonid pKa karboksüülrühmale ca 2.2 pKa aminorühmale ca 9.4

  5. Näide: seriini tiitrimine pKa2 = 9.2 Isoelektriline punkt- pH väärtus, kus ühendi summaarne elektrilaeng on null pI=1/2(pKa1 + pKa2) =5.7 pKa1 = 2.2

  6. a-aminohapped – valkude koosseisu kuuluvad monomeerid 20 aminohapet on standardsed ehk klassikalised, erinevad üksteisest R poolest Milleks nii erinevad kõrvalahelad? -valkude struktuurse ja funktsionaalse mitmekesisuse tagamine a-süsinik ja neli asendajat: R- kõrvalrühm aminorühm karboksüülrühm H-aatom -laeng -geomeetria -keemilised omadused

  7. Valgud ja aminohapped • Valgud, polüpeptiidid- lineaarsed aminohappe jääkidest koosnevad polümeerid • Valkude primaarstruktuur defineeritud nukleiinhappe järjestuse poolt • Mw alates ca 5000 (5 kD)- vähemalt 500kD • Valkude struktuurne ja funktsionaalne mitmekesisus baseerub 20 erineva aminohappe kombinatsioonidel

  8. Alaniin Ala A Arginiin Arg R Asparagiin Asn N Asparagiinhape Asp D Glutamiin Gln Q Glutamiinhape Glu E Glütsiin Gly G Histidiin His H Isoleutsiin Ile I Leutsiin Leu L Lüsiin Lys K Metioniin Met M Fenüülalaniin Phe F Proliin Pro P Seriin Ser S Treoniin Thr T Trüptofaan Trp W Tsüsteiin Cys C Türosiin Tyr Y Valiin Val V Suvaline ah . Xaa X Asn või Asp Asx B Gln või Glu Glx Z

  9. Aminohapped on optiliselt aktiivsed Optiline aktiivsus- polariseeritud valguse tasapinna pööramine Optiliselt aktiivsed molekulid on asümmeetrilised Asümmeetria ehk kiraalne tsenter- a süsinik Asümmeetria tsentrit ei ole glütsiinil dextro D- levo L- L-aminohape R ja S Enantiomeerid Stereoisomeerid D-glütseeraldehüüd L-glütseeraldehüüd Fisheri projektsioon: -vertikaalsed sidemed suunatud tasapinna alla -horisontaalsed sidemed tasapinna ette

  10. Peptiidside Peptiidside- amiidside Moodustub kondensatsioonireaktsioonis Di, tri, …oligo ja polüpeptiidid N terminus ja C terminus NB! Valkudes sageli rohkem kui 1 ahel DG0on ca 20 kJ/mol st piisab 1 ATP hüdrolüüsi energiast Biosüntees ATPjAMP + 2Pi 2GTPj2GDP + piS=4 ATP Peptiidside on vesikeskkonnas suhteliselt stabiilne Aktivatsiooni vabaenergia DG0* on ca 80 kJ/mol

  11. Aminohapped ja peptiidid: nomenklatuurist 5´AUGUCUUCCGCCUUUCUG 3´ RNA järjestus Met Ser Ser Ala Phe Leu kolmetähelised sümb. M S S A F L ühetähelised sümb. N terminusC terminus

  12. Geneetiline kood on tripletne – XYZ , näit. AGC- Ser 2. positsioon U C A G Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C 1. Pos. Leu Ser XXX XXX A 3. Pos. Leu Ser XXX Trp G Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Miks on 20 aminohapet? 64 koodonit? tripletne kood? Vastused on sõltuvad muna-kana probleemi lahendusest

  13. Aminohapete klassifikatsioon Vastavalt R asendajale mittepolaarne polaarne laenguta laenguga happelised laenguga aluselised S sisaldav aromaatne Aminohapete Mw 57…186 D, Keskmine aminohappejäägi mass valgu koostises ca 110 D 25 ah jäägist koosnev peptiid 110 x 25 = 2750 = 2.75kD

  14. Mittepolaarse kõrvalahelaga aminohapped I Glütsiin Gly G Isoleutsiin Ile I Alaniin Ala A Gly -puudub kõrvalahel, kiraalne C -peptiidahelas võimalikud anomaalsed nurgad -H aatomi väikesed mõõtmed, tihe pakkumine Ala -väike, mittepolaarne -võib paikneda nii valkude sisemuses kui pinnal -sageli esinev -kasutatakse sageli valkude muteerimisel, minimaalse struktuurse efekti tõttu Valiin Val V Val, Leu, Ile -hargnenud, mahukad, hüdrofoobsed -paiknevad valkude sisemuses -piiratud liikuvusega, eriti kui hargnemine Cb juures Leutsiin Leu L

  15. Mittepolaarse kõrvalahelaga aminohapped II Metioniin Met M Suured mittepolaarsed aminohapped asuvad tavaliselt valgugloobuli sees Val Leu Ile Trp Tyr Phe Pro Met Fenüülalaniin Phe F Pro on ainuke iminohape, tsükliline kõrvalahel seotud peaahelaga. Väga jäik struktuur, fikseerib peaahela Ca-NH dihedraalnurga 20o täpsusega Proliin Pro P Rida aminohappeid on vaadeldavad alaniini derivaadina. Metüleenrühm CH2 võimaldab peaahelal võtta rohkem konformatsioone Trüptofaan Trp W

  16. Polaarse neutraalse kõrvalahelaga aminohapped I Seriin Ser S Polaarsed kõrvalahelad on võimelised moodustama vesiniksidemeid olles nii doonoriks kui akseptoriks Treoniin Thr T Asparagiin Asn N

  17. Polaarse neutraalse kõrvalahelaga aminohapped II Glutamiin Gln N Türosiin Tyr Y Tyr kõrvalahel sisaldab fenoolset OH rühma, mis moodustab vesiniksidemeid ja on võimeline dissotseeruma kõrgema pH juures. Samuti võib dissotseeruda Cys Cys unikaalne omadus on disulfiidsildade S-S moodustamine teise Cys jäägiga. Tsüsteiin Cys C

  18. Laengut omava kõrvalahelaga aluselised aminohapped Lüsiin Lys K Arginiin Arg R Histidiin His H Laeng kõrvalahelal on toodud neutraalse pH juures. Unikaalne on His, mille kõrvalahela pKa=6.0 Seega võib His kõrvalahel nii liita kui loovutada prootoni ja osaleda katalüüsis. Esineb väga paljude ensüümide aktiivtsentris

  19. Laengut omava kõrvalahelaga happelised aminohapped Asparagiinhape Asp D Glutamiinhape Glu E

  20. Kõrvalahelate aluselis-happelised omadused Aminohape funkts. rühm pKa Cys sulfhüdrüül 8.37 Tyr fenool 10.46 Lys e-NH3+ 9.06 Arg guanidino 12.48 His imidasool 6.04 Asp b-COOH 3.90 Glu g-COOH 4.07

  21. Aminohapete derivaadid valkude koosseisus • Kõrvalahelad: • Hüdroksüleerimine • Metüleerimine • Atsetüleerimine • Karboksüleerimine • Fosforüleerimine karbohüdraadid lipiidid N ja C terminuse modifikatsioonid

  22. Bioloogiliselt aktiivsed aminohapped D-aminohapped • Bakteriraku kestad • Antibiootikumid • valinomütsiin • gramitsidiinA • aktinomütsiinD • GABA • Dopamiin • Histamiin • Türoksiin a. b. c. d.

  23. Valk …. proteiin …. proteios … esmatähtis Gerardus Mulder, Taani keemik eraldas loomsetest ja taimsetest kudedest valgulise aine nimetas aine Berzeliuse (Rootsi keemik) soovitusel PROTEIINIKS (1838) määras valemiks C40H62N10O12

  24. Valgud • Valgud võivad koosneda ühest või mitmest polüpeptiidahelast. • Monomeersel valgul on ainult üks subühik • Oligomeersel (multimeersel) valgul on mitu subühikut • Multimeersete valkude subühikud võivad olla identsed või erinevad. Subühikud on tavaliselt seotud mittekovalentsete sidemetega • Valkude suurus algab ca 5kDa suurusjärgust ja ületab 0.5MDa. • Polüpeptiidid ja valgud on aminohappe jääkidest koosnevad lineaarsed (hargnemata ahelaga) polümeerid. • Aminohappeline järjestus on primaarstruktuur

  25. Valkude klassifikatsioon • Funktsionaalselt • Lokalisatsiooni alusel • Lihtvalgud ja liitvalgud • glükoproteiinid, lipoproteiinid, nukleoproteiinid, metalloproteiinid jne • Strukturaalselt ja vastavalt vees lahustuvusele • globulaarsed • fiibervalgud E. coli – ca 3000 valku S. cerevisiae - ca 6000 valku H. sapiens - ca 30000-100000 valku

  26. Liitvalkude ehk konjugeeritud valkude klassid Klass Prosteetiline rühm Näide Lipoproteiinid lipiidid vere b1-lipoproteiin Glükoproteiinid süsivesik immunoglobuliin G Fosfoproteiinid fosfaatrühm kaseiin (piimavalk) Hemoproteiinid heem (Fe-porfüriin) hemoglobiin Flavoproteiinid flaviinnukleotiidid suktsinaadi dehüdrogenaas Metalloproteiinid raud ferritiin tsink alkoholi dehüdrogenaas kaltsium kalmoduliin molübdeen dinitrogenaas vask plastotsüaniin

  27. Mõnede valkude molekulmassid Valk Mw subühikuid funktsioon Glükagoon 3300 1 hormoon Insuliin 11466 2 hormoon TsütokroomC 13000 1 elektronide transpot RibonukleaasA (pankr.) 13700 1 ensüüm Lüsotsüüm (munavalgest) 13900 1 ensüüm Müoglobiin 16900 1 hapniku transport Kümotrüpsiin 21600 1 ensüüm Karboonanhüdraas 30000 1 ensüüm Peroksüdaas (mädarõik.) 40000 1 ensüüm Hemoglobiin 64500 4 hapniku transport Heksokinaas (pärm) 102000 2 ensüüm Laktaadi dehüdrogenaas 140000 4 ensüüm Glükogeeni fosorülaas 194000 2 ensüüm Fosfofruktokinaas (lihas) 340000 4 ensüüm Ferritiin 440000 24 Fe säilitus Glutamiini süntaas (E.coli) 600000 12 ensüüm

  28. Valkude funktsionaalsed klassid • Ensümaatiline katalüüs (CO2 hüdrateerimine, karboonanhüdraas; RNA süntees) • Transport- ja (hemoglobiin ja müoglobiin O2 transport; transferriin • säilitusfunktsioon Fe transport; ferritiin Fe säilitamine maksas) • 3. Koordineeritud liikumine (lihaste kontraktsioon; kromosoomide liikumine mitoosis) • Strukturaalne (nahk ja kondid sisaldavad kollageeni) • Immuunvastus (IgA, IgG, IgM) • Närviimpulsi teke ja ülekanne (retseptorvalgud meeleelundites, sünapsis) • Rakkude, kudede, organismi (geeniekspressiooni kontroll, hormonaalne reg.) • kasv ja diferentseerumine

  29. Proteoomika- kõigi organismi (raku) valkude kompleksne uurimine Valgud E. coli rakkudest lahutatud 2D O`Farrelli geelil

  30. Aminohapete kõrvalahelad määravad valkude struktuurse ja funktsionaalse mitmekesisuse 20 aminohappe kombinatsioonide hulk on väga suur, Limitatsioonid looduses tavalised 100-1000 jäägi pikkused polüpeptiidid 20 aminohapet esinevad erineva sagedusega Sageli esinevad: L, A, G, S, V, E Harva esinevad: W, C, M, H NB! Valgu omadused ei sõltu niivõrd aminohappelisest koosseisust kui järjestusest

  31. Aminohapete kõrvalahelad määravad valkude struktuurse ja funktsionaalse mitmekesisuse Valgu laeng määratakse ära kõrvalahelate ionisatsiooni tulemusena pI- isoelektriline täpp, vastab pHle kus laeng puudub Polüpeptiidahela otsmised rühmad osalevad tüüpilistes funktsionaalrühma reaktsioonides Aminohapete kvantitatiivne määramine on võimalik ninhüdriiniga Reale kõrvalrühmadele on olemas spetsiifilised reaktsioonid Aromaatsete kõrvalahelate neelduvus spektri UV alas võimaldab valkude kontsentratsiooni mõõta Lainepikkus 230 või 280 nm Trp, Tyr, Phe - Aromaatsed Valgu molaarse ekst. koef. arvutatav, Tundmatu järjestuse korral 1 mg/ml OD280=1

  32. Valkude struktuur? • Bioloogiliste makromolekulide struktuur kirjeldatakse erinevatel tasanditel • primaarstruktuur • sekundaarstruktuur • tertsiaarstruktuur • kvaternaarstruktuur PRIMAARSTRUKTUUR. Aminohappe jääkide lineaarne järjestus a-heeliks b-leht SEKUNDAARSTRUKTUURID DOMEENID ehk SUPERSEKUNDAARSTR KVATERNAARSTRUKTUUR 4 hemoglobiini b ahelat moodustavad Oligomeerse valgu molekuli KVATERNAARSTRUKTUUR- a ja b tubuliini assotseerumine mikrotorukeseks TERTSIAARSTRUKTUUR Hemoglobiini b ahel

  33. Valkude primaarstruktuuri määramine • Esimeseks ülesandeks on valgu puhastamine. Enamik valke on kättesaadavad väikesel hulgal • Aminohappeline kosseis on määratav täieliku valgu hüdrolüüsiga (6M HCl, 100oC, 12-24 tundi) ja hüdrolüsaadist aminopapete hulga mõõtmine kromatograafiliselt

  34. Valkude sekveneerimine Valgu või nukleiinhappe järjestuse määramist nimetatakse sekveneerimiseks • Edmani degradatsioon • Põhilisi valgu sekveneerimise meetodeid • Baseerub valgu molekuli sammhaaval degradeerimisel N-terminusest • Protsess on automatiseeritav ja võimaldab saada informatsiooni umbes 50 aminohappe jäägi jaoks alates N-terminusest

  35. Valkude sekveneerimine Sekveneerimine=primaarstruktuuri määramine Insuliin, 51 aminohappe jääki 1953 ca 10 aastat ja 100g Kaasajal mõni mikrogramm, 1 päev Sanger, Nobeli preemia 1956

  36. Edmani degradatsioon: probleemid • Reaktsioon ei kulge 100%- segatud produktid • Limiteeritud ca 50 tsükliga ja seetõttu tuleb enamus valke eelnevalt lühemateks peptiidideks hüdrolüüsida • Disulfiidsidemed tsüsteiinide vahel tuleb redutseerida • N-terminaalne peptiidi ots ei tohi olla modifitseeritud

  37. Valkude sekveneerimine Valgu primaarstruktuuride andmebaas- Swiss Protein Database 29.juuli 2002- 101290 kirjet Suur osa on saadud valgu geeni järjestuste transleerimisel • Valguperekondade identifitseerimine • Sarnase primaarstruktuuriga valgud on sageli lähedase bioloogilise funktsiooniga • Võimalik in silico eksperimenteerida • Näide: proteiinkinaasid • Ensüümid, mis katalüüsivad spetsiifiliste aminohappejääkide fosforüleerimist • Kõik tuntud kinaasid omavad ühist sarnast ca 240 jäägi pikkust järjestust • Näide: tsütokroom c • Valk, mis osaleb aeroobses metabolismid • Järjestus teada ca 100 organismist • 27 aminohapet ca 105-st on identsed, teistes variatsioonid evolutsiooni käigus tekkinud

  38. Valkude puhastamine Iüldprintsiibid • Puhastamise lähtematerjali valik • Valkude stabiliseerimine (ph, to, degr. ensüümid, adsor) • Valgu jälgimine puhastamise käigus (Assay) • Lahutamise meetodid • Laeng (ioonvahetuskromatograafia, elektroforees) • Polaarsus ( hüdrofoobse interaktsiooni kromat.) • Molekuli suurus (geelfiltratsioon, SDS-PAGE, tsentrifuugimine) • Sidumise spetsiifilisus (afiinsuskromatograafia)

  39. Valgu puhastusskeem (E.coli laktoosi transporter)

  40. Valkude kromatograafia ja elektroforees Valkude isoleerimise meetodide rakendamiseks tuleb esmalt valk lahusesse viia, st. saada sobiv raku ekstrakt. Valkude lahustuvus on erinev ja vastavalt sellele ka ekstrakti valmistamise meetodid varieeruvad Valkude lahutamise meetoditest peatume kahel: Kromatograafilised meetodid Elektroforees

  41. Kromatograafia Kõik kromatograafilised meetodid baseeruvad biomolekulide korduval selektiivses jaotumises kahefaasilises süsteemis. Biomolekulide puhastamisel on kasutusel näiteks: ioonvahetuskromatograafia õhukese kihi kromatograafia pöördfaaskromatograafia geelfiltratsioonkromatograafia afiinsuskromatograafia jt.

  42. Valkude puhastamine geelfiltratsioonil

  43. Valkude puhastamine ioonvahetuskromatograafial

  44. Geelelektroforees • Põhimõte- lahutamine poorses keskkonnas elektrivälja toimel • Kasutatavad polüakrüülamiid geel (PAAG) ja agaroos • SDS PAGE • Isoelektriline fokuseerimine • Biomolekulide detekteerimise meetodid geelis

  45. Valkude lahutamine SDS geelelektroforeesil Meid huvitava valgu Mw on määratav võrdluses standardvalkudega Valkude identifitseerimiseks on võimalik geel värvida valgu spetsiifilise värviga Samuti on võimalik kasutada spetsiifilisi antikehasid

  46. Kodutöö nädalavahetuseks Selgeks saada 20 aminohappe struktuur, kolmetäheline lühend, ILMA PIILUMATA Joonistada L-alaniini 4 Fischeri projektsiooni Joonistada järgmine oligopeptiid korrektses ioniseerunud vormis (füsioloogilistes tingimustes) Gln-His-Ile-Thr Joonistada dominantne ioonne vorm aminohappele Asp a. pH1.0, b. pH3.0, c. pH6.0, d. pH10.0 juures

More Related