实验 54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒 DNA 的转化、提取与酶切鉴定

实验54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定制作人：刘如石

一. 实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。

二.实验原理 1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经

过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子

RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合

处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：

(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI与BglII。

影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度；酶切消化反应的温度； DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染

色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA的分子大小；琼脂糖浓度； DNA构象；电场强度；碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。三．实验材料与设备： 1、用品与与仪器：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头、烧杯、量筒

镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-PDIP-r质粒(AmpR) 2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌；氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50µg／mL浓度50-100µg／mL）；

0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸水中，定容到100mL，过滤后灭菌；0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸水中，定容到100mL，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl2 15％甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内含有15ml甘油，高压灭菌；溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)；溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；

5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油；无水乙醇； 70％乙醇；标准分子量片段；核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)；琼脂糖；溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。

四．操作步骤: (一) 感受态细胞的制备： 1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；

CaCl2纯度至关重要，不同厂家， 甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5、0～4℃，4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； 6、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

（二）质粒DNA的转化： 1、每100µL感受态细胞悬液中加入1µL质粒DNA,轻轻摇匀，同时设置三组对照：(1)不加质粒，(2)不加受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒DNA，具体操作按下表进行： *阳性对照，用已知具有转化活性的pGEX-PDIP-r质粒DNA进行转化

2、冰上放置20～30min，然后42℃水浴热激90～120 Sec，迅速冰上冷却2min； 3、立即向上述Ep管中加入0.8mL LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约15～30min，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因； 4、取培养液50µL接种于含抗菌素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀； 5、将培养皿放在37℃恒温培养箱培养30 min,待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(14-16h) ；（三）碱裂解法小量制备质粒DNA:

1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时；1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时； 2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解。 4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构

5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min；溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于－20℃或直接用于酶切。

质粒图谱:

(四)提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1、在0.5mL Ep管中依次加入下列溶液于0.5ml离心管中提取质粒DNA 3.0 L 10× buffer H 1.0 l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8 L 10 L 1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在20 L 反应液中反应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量. 2、轻轻混匀, 4000g离心10秒，置于37℃水浴中酶解1.5h。 3、酶解完成后，加入1.2 l 10×上样缓冲液(或2 l 6×上样缓冲液), 混匀. 4、称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL 0.5×TBE或1×TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。

5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴EB，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡（厚度约为3～4mm）；5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴EB，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡（厚度约为3～4mm）； 6、室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子。 7、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有0.5×TBE或1×TAE缓冲液的电泳槽中使用(注意:电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。 8、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（80～100V的电压下电泳，一般情况下，电压/电极间距离应小于5V/cm），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。

9、在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带(在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系统)。9、在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带(在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系统)。

五. 实验结果报告： 1、转化效率的计算：转化子总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）转化效率（每微克质粒DNA的转化子数）＝转化子总数（个转化子）/加入质粒DNA的量（μg） 2、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。

六、思考题： 1、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据是什么？ 2、为什么通常使用R-M-菌作为基因工程受体菌？ 3、简述CaCl2制备细菌感受态细胞及其转化的基本原理。 4、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？ 5、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用机理是什么？ 6、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。

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