Marina Casselyn

1. MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Marina Casselyn Thèse effectuée sous la direction d’Hervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP)

2. MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV

3. Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV PRESENTATION DU VIRUS I

4. 100 nm coloration négative Le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) est particulier aux graminées. Le BMV est produit au laboratoire par inoculation de plants d’orge. Le rendement est de 100 mg de virus pour 100 g de feuilles infectées. I

5. Caractéristiques du BMV coque protéique lumen ARN 270 Å • capside « sphérique » de 270 Å de diamètre • le virus n ’est pas enveloppé • le centre du virus est creux • génome à ARN simple brin tripartite (enzymes de réplication, protéine de capside, protéine de mouvement) • masse de 4,6 MDa I

6. Prolifération virale protéines de capside ARN polymérases protéines de mouvement désassemblage co-traductionnel pH > 7 pH < 7 I

7. Symétrie de la capside ABC (d’après Speir et coll., 1995) La capside résulte de l ’auto-assemblage de 180 protéines identiques selon une symétrie icosaèdrique. Les protéines A, B et C ont des séquences identiques, mais des structures quasi-équivalentes. A, B et C constituent l’unité asymétrique de la capside. Le virus a un nombre de triangulation T=3. I

8. structure du CCMV (70% d’identité de séquence avec le BMV) modélisation par homologie de séquences capsomères (hexamères et pentamères) remplacement moléculaire structure atomique du BMV (réf. PDB 1js9 – Lucas et coll; 2002) Structure atomique du BMV I

9. Stabilisation de la capside A B C A C-ter C-ter B interpénétration entre dimères fixation d’ions divalents à la surface I

10. Stabilisation de la capside l’ARN tapisse l’intérieur de la capside les 6 protéines B et C forment un tonneau  I

11. Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV MODELISATION PAR CRYOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE DES FORMES COMPACTE ET GONFLEE DU BMV A 30 Å DE RESOLUTION Collaborations : Nicolas Boisset (LMCP) Célia Plisson (ICM) II

12. TECHNIQUES • Cryomicroscopie électronique • La vitrification à -180°C permet • l’observation des macromolécules dans leur état natif • une plus grande résistance des échantillons aux radiations • Reconstruction 3D (effectuée par C. Plisson, ICM) • observation de l ’ARN viral, dont l ’organisation ne peut pas être déterminée par diffraction des rayons X • étude de la structure du BMV à l ’état gonflé, car les particules virales ont des diamètres hétérogènes à pH 7,5 ce qui empêche la cristallisation II

13. Microscopie forme compacte pH 5,9 forme gonflée pH 7,5 Diamètre des particules virales à pH 5,9 : 280 Å à pH 7,5 : 304 Å II

14. Reconstruction 3D 270 Å 304 Å Gonflement de la capside à pH 5,9 : existence de pores au niveau des axes 5 et des pseudo axes 6. à pH 7,5 : - déplacement des capsomères - apparition de pores au niveau des pseudo axes 3 II

15. ARN 120 Å 160 Å Réorganisation de l’ARN l’ARN se plaque contre la paroi interne, et obstrue les axes 5. II

16. 2 théories pour la libération de l ’ARN : (Speir et coll., 1995) (Albert et coll., 1997) 1- L’ARN serait libéré à travers des pores qui se forment lors du gonflement du virus, au niveau des pseudo axes 3 2- Même si l’on empêche le gonflement de la capside, le virus prolifère. L’ARN serait libéré à travers les axes 5 icosaèdriques. II

17. CONCLUSION Suite à l’augmentation du pH, l ’ARN se positionne au niveau des axes 5 icosaèdriques. La sortie de l ’ARN se ferait au niveau des pentamères, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’Albert et coll. II

18. Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Collaborations : A. Tardieu (LMCP) J. Perez, P. Vachette (LURE) J. Witz (IBMC) III

19. Objectifs des études  caractériser les interactions en solution d ’un nouveau modèle de macromolécule sphérique en fonction de différents paramètres physico-chimiques établir les relations entre interactions et conditions de cristallisation  III

20. 4 10 3 10 I(c,s) 2 10 10 1 0 0.005 0.01 0.015 0.02 -1 s(A ) Diffusion des Rayons X aux Petits Angles L’intensité diffusée I(c,s) par une solution de concentration c, en fonction du vecteur de diffusion s=2 sin /  , donne des indications sur: - la nature des interactions entre particules en solution - la forme et la taille des particules III

21. Interactions intermoléculaires en solution • les forces répulsives de volume exclu • les forces de van der Waals • les forces coulombiennes • les forces attractives de déplétion, en présence de polymères III

22. Induction d ’un régime attractif  Modification de la charge des virus : • variation du pH de 4 à 7,5 • ajout d ’anions. Les ions n’écrantent pas seulement les charges mais ont un effet différentiel sur les interactions en solution, l’effet Hofmeister SO42-<HPO42- < CH3CO2-~C6H5O73- < HCO3-< Cl- < Br- < NO3-< ClO4-< SCN-  Induction d’interactions attractives de déplétion par ajout de polyéthylène glycol III

23. Quantification des interactions facteur de forme signal diffusé par une particule unique facteur de structure caractérise la répartition des particules en solution attraction S(c,s) S(c,s) 1 1 I(0,s) I(0,s) s (Å-1) s (Å-1) s (Å-1) s (Å-1) répulsion I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) Par extrapolation du facteur de structure à l’origine, S(c,0), en fonction de la concentration, on accède au second coefficient du viriel A2 (mol.ml.g-2) A2 < 0 A2 > 0 1/S(c,0)=1+2MA2c /cRT=1+A2Mc+A3Mc2+… III

24. Effets de la variation du pH L’augmentation du pH provoque une diminution des interactions répulsives. La valeur du second coefficient du viriel A2 passe de 2.10-6 à 7.10-7 mol.ml.g-2. La variation du pH provoque un changement de structure du virus III

25. Modèles de sphères creuses courbes exp. modèles Conséquence de l’augmentation du pH : la diminution du rayon interne du virus, correspondant à une réorganisation de l’ARN III

26. Le NaNO3 est plus efficace que l’AcNa pour diminuer les interactions répulsives : effet Hofmeister Effets des sels III

27. Effets du NaN03 (pH 4) La valeur de A2 passe de 2.10-6 à 5.10-7 (mol.ml.g-2) La présence de sels provoque également une réorganisation de l’ARN III

28.  La variation du pH et l’ajout de sels en solution provoquent une réorganisation structurale du BMV La variation de ces deux paramètres n’induit pas d’interactions attractives pouvant amener à la cristallisation du BMV  Conclusions sur les effets du pH et des sels III

29. 2Rg Rg 270 Å III Effets du polyéthylène glycol (PEG) (-CH2OCH2-)n RgPEG 3000 : 23Å RgPEG 8000 : 40 Å RgPEG 20000 : 70 Å L’ addition de PEG induit une attraction entre molécules. Il s’agit d’une « attraction de déplétion ».

30. Effets du PEGsur le BMV en solution 4 1.2 10 PEG 8000 4% 4 1.5 10 6% BMV 40mg/ml PEG 20 000 4% 8% 10% 5mg/ml BMV 3 8 10 10mg/ml BMV 4 1 10 20mg/ml BMV 40mg/ml BMV I(c,s) I(c,s) pics de diffraction 3 4 10 3 5 10 pics de diffraction 0 0 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 s(A-1) -1 s(A ) - l’effet du PEG est relié à sa concentration - l’effet du PEG est relié à sa taille - les précipités sont microcristallins III

31. Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN PRESENCE DE PEG IV

32. PEG: diagrammes de phase et cristallisation IV

33. 60 50 courbe de solubilité 40 BMV concentration (mg/ml) courbe de précipitation 30 20 10 0 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% % PEG 8000 (w/v) les conditions de précipitation permettent de prédire les conditions de cristallisation Diagrammes de phase IV

34. Cristallisation du BMV 200 µm 10 % PEG 8000, pH 4 Microbatch les cristaux sont obtenus de façon reproductible, en présence de PEG seul Diffusion de vapeur 4 % PEG 8000 , pH 4 8 % PEG 8000, pH 4 (coll. C. Mayer, LMCP) IV

35. Cinétique d’apparition et de croissance des microcristaux Collaboration : S. Finet (ESRF) IV

36. Ligne ID2 à l ’ESRF I(s) 2q s= 2sinq/ l l =1Å RX échantillon détecteur 2D - le « stopped-flow » permet le mélange rapide de l ’échantillon - la première mesure est effectuée 180 ms après le mélange - chaque mesure dure 50 ms - le faisceau est coupé entre 2 mesures consécutives stopped-flow IV

37. PEG 3000 PEG 20000 PEG 8000 Conditions étudiées 2,5 à 20mg/ml de virus 2,5 à 10% de PEG IV

38. Signaux caractéristiques des échantillons échantillon non précipité échantillon précipité microcristallin IV

39. Obtention du facteur de structure phase liquide phase solide division par le facteur de forme I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) IV

40. Indexation des pics de diffraction a=b=c=390 Å 4 virus dans la maille (h2+k2+l2) L’espacement des pics de diffraction est compatible avec une maille cubique face centrée IV

41. Caractérisation des pics de diffraction 1/taille des microcristaux largeur des pics nombre de microcristaux N nombre de virus dans les microcristaux n2 hauteur des pics t>0 t>0 temps temps t=0 t=0 la croissance des pics est due principalement à la formation de nouveaux microcristaux la croissance des pics est due principalement à la croissance des microcristaux existants IV

42. 1800 Å « 3ème pic » largeur du pic 800Å temps concentration PEG 3000 10%, BMV 20 mg/ml IV

43. les noyaux de nucléation ont une structure cristalline, et un diamètre d’environ 800 Å Premières conclusions  Il n’existe que deux espèces en solution : le virus soluble, et le virus cristallisé. Les plus petits microcristaux ont un diamètre de 800 Å (de l’ordre de 20 particules virales)  IV

44. PEG 20000 10%, BMV 10 mg/ml PEG 8000 10%, BMV 10 mg/ml • Les pics apparaissent plus nombreux et mieux différenciés avec le PEG 20 000 qu ’avec le PEG 8 000 • On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline IV

45. Croissance des pics en fonction de la concentration en virus La hauteur des pics est reliée à la concentration initiale en virus et au nombre de microcristaux. IV

46. Conclusions  • L’apparition des microcristaux est directement reliée à: • - la taille et la concentration du PEG • - la concentration en virus • La croissance des pics est principalement due à la formation de nouveaux microcristaux • L’apparition puis la croissance des pics de diffraction s ’effectue au cours des premières secondes après le mélange   IV

47. CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

48. L’ARN se plaque contre la paroi interne du virus lors du gonflement de la capside La cristallisation du BMV a lieu dans des conditions attractives, qui peuvent être prédites Les noyaux de nucléation des macromolécules sphériques auraient une structure cristalline. Déterminer la structure du BMV à partir des cristaux obtenus en présence de PEG Déterminer la forme, sphérique ou plane, des noyaux de nucléation - AFM - cryodécapage

50. Technique de la Transformée de Fourier Polaire (TFP) Baker et Cheng,1996 sélection des particules virales « 2D » sélection des particules virales « 2D » projections 2D TFP conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r,) conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r,) TF-1 TF-1 TF TF TF-1 sélection des particules correctement orientées par rapport à la banque de TFP sélection des particules correctement orientées par rapport au nouveau modèle banque de “transformées de Fourier polaires” détermination de l’origine et de l’orientation des particules sélectionnées Modèle de départ : virus de l’hépatite B (Conway et coll., 1997) détermination de l’origine et de l’orientation des particules sélectionnées