Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae

1. Melissa PETITI M2 MBVB Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-hôtes Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae

2. Introduction Vibriocholerae • Bactérie gram – • 1 flagelle polaire • Sécrétion de la toxine cholérique Figure 1 : V. choleraeobservées au microscope électronique

3. Introduction Le système de sécrétion de type 2 • Prise en charge des protéines après translocation dans le périplasme via Sec/Tat • Complexe inséré dans les deux membranes • Analogie avec le Pilus de type IV Figure 2 : Modèle de sécrétion des protéines via le SST2 Chez P. aeruginosa(Voulhouxet al. 2001)

4. Introduction Modèle du SST2 chez V. cholerae • Complexe protéique codé par les gènes eps • EpsD : sécrétine • EpsE : ATPase de trafic • EpsG : pseudopilus ( + Eps HIJK ) • EpsM, L, C et F : plateforme de membrane interne Figure 3 : Modèle du SST2 chez V. cholerae

5. Partie 1 2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire Figure 4 : Localisation des protéines de fusion pGFP-EpsL et pGFP-EpsM (Scott et al. 2001) Figure 5 : Microscopie à fluorescence en temps réel pour la protéine de fusion pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)

6. 1 : Localisation cellulaire de la protéine pGFP-EpsM EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ? • Observer la localisation cellulaire des protéines codées par les gènes eps Fusion des protéines d’intérêt à la GFP Expression à partir d’un plasmide avec et sans induction dans une souche mutante

7. 1 : Localisation cellulaire De la protéine pGFP-EpsM La distribution native d’EpsMn’est pas aux pôles cellulaires • Induction à l’IPTG : Foyers de fluorescence aux pôles de la cellules • Sans induction : Fluorescence visible à la périphérie de la cellule Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine chimère pGFP-EpsM dans une souche mutante epsM

8. Partie 2 Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome • Observer la localisation cellulaire des protéines GFP-Eps produites à partir du chromosome copies chromosomiques des gènes eps remplacées par les copies fusionnées à la GFP (souches gfp-epsC et gfp-epsM) vérifier la production des protéines vérifier la fonctionnalité du système avec ces fusions

9. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsMet GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

10. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsMet GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM GFP-EpsC GFP-EpsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

11. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines de fusion GFP-EpsMet GFP-EpsC sont produites 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM GFP-EpsC GFP-EpsM EpsC EpsM Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

12. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles • Mesure de l’activité des protéases sécrétées par V. cholerae via le SST2. • Les protéines de fusion sont des composants fonctionnels du SST2 Tableau 1 : Mesure de l’activité protéase des souches WT et possédant les fusions

13. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire • GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule • GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

14. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire • GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule • GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

15. 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire • GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule • GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

16. Partie 3 Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes SST2 ? • Observer la co-expression des protéines natives et chimères. souche gfp-epsM+ pEpsM souche gfp-epsC + pEpsC • Construction de souches dans lesquelles l’opéron epsest sous le contrôle d’un promoteur inductible • Introduction des fusions gfp-epsC et gfp-epsM sur le chromosome PBAD::epsgfp-epsC PBAD:: epsgfp-epsM

17. 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Les protéines natives ont remplacé les protéines chimères dans le complexe • Signal GFP diffus dans les cellules • Absence de foyers distincts de fluorescence A B Figure 9 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM dans des souches contenant respectivement les plasmides pEpsC et pEpsM

18. 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Le nombre de foyers et le taux de sécrétion augmentent avec le niveau d’expression x7 Figure 11 : quantification des foyers de fluorescence et mesure de l’activité protéase correspondante Figure 10 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM avec ou sans induction du promoteur pBAD

19. 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Les modèles précédents sont-ils fidèles à la distribution WT des protéines Eps • Localisation du complexe SST2 par immunofluorescence Anticorps anti-EpsC Anticorps anti-EpsG

20. 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? EpsG est distribuée à la périphérie des cellules WT WT ΔepsG ΔepsG Figure 12 : Localisation de la protéine EpsG native par immunofluorescence dans une souche WT et une souche ΔepsG

21. Partie 4 Comment s’assemble la machinerie SST2 ? • Relation entre le cytosquelette bactérien et le SST2 inhibition des filaments MreB et observer l’effet sur le SST2 Rôle d’ancrage, d’arrimage du complexe ? • Mutations des gènes epsdans les souches gfp-epsC et gfp-epsM observer l’effet de ces mutations sur la sécrétion des protéines observer l’effet de ces mutations sur la localisation des protéines chimères

22. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule Figure 13 : Localisation cellulaire de MreB (Jones et al. 2001)

23. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Le SST2 s’assemble indépendamment des filaments MreB ExtB Figure 15 : Effet du A22 sur le niveau de sécrétion Figure 14 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC et croissance bactérienne après traitement de la souche gfp-epsC au A22

24. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les mutations affectent la fonction du complexe SST • L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 2 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées

25. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les mutations affectent la fonction du complexe SST • L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 3 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées

26. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsD est requise pour un assemblage focal d’EpsC • ΔepsD: fluorescence diffuse Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps

27. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM et EpsL stabilisent EpsCà la périphérie de la cellule • ΔepsM ou ΔepsL: fluorescence aux pôles en phase stationnaire Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps

28. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM requière EpsCpour sa localisation • ΔepsC: fluorescence diffuse Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

29. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsM requière EpsD et EpsCpour sa localisation • ΔepsD: fluorescence diffuse Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

30. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte d’EpsM Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps

31. 4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ? Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées • 11% de foyers jaunes : complexes SST2 assemblés. • Foyers verts ou rouges : complexes dont l’assemblage n’est pas terminé. Figure 17 : Colocalisation des protéines GFP-EpsM et mCherry-EpsC dans une souche WT de V. cholerae

32. Conclusion Enfin un premier modèle d’assemblage du SST2 ! • 2009 : Première publication au sujet de l’assemblage du SST2 • Localisation membranaire latérale • Importance de la stœchiométrie entre les partenaires • Mise en évidence d’un modèle d’assemblage

33. Conclusion Modèle d’assemblage • EpsD semble être l’initiateur de la formation du complexe • EpsCs’associe pour former un complexe mais interaction directe ? • EpsLet EpsM s’assembleraient ensuite et EpsM stabiliserait cette interaction

34. Conclusion Pour aller plus loin • Étude des interactions protéine/protéine physique (co-IP, double hybride) • Etude interactions protéine/protéine par fluo (dynamique)

35. Merci de votre attention !