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Tecniche Cromatografiche

Tecniche Cromatografiche. Seconda parte. Cromatografia per interazione idrofobica (HIC). È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie.

Albert_Lan
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Tecniche Cromatografiche

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Presentation Transcript

  1. Tecniche Cromatografiche Seconda parte

  2. Cromatografia per interazione idrofobica (HIC) • È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie. • I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate • le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. • È una cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. • L’eluizione può essere fatta con forza ionica decrescente oppure per “spiazzamento” con detergenti non ionici (Tween 20, Triton X-100). • Potenziali svantaggi: • in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione. • non è predicibile, può applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre.

  3. Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

  4. Cromatografia di affinità • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice • La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna • Le altre proteine vengono “lavate” via. • La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

  5. Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità

  6. VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame L’eluizione può richiedere un eluente specifico Cromatografia di affinità

  7. Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: TAG GST MBP biotina Poli-His Proteina A Affinity tags • LIGANDO • Glutatione • Maltosio • Avidina • Nichel, Zinco • Anticorpi • Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. • Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

  8. Purificazione di anticorpi monoclonali

  9. Cromatografia di affinità con anticorpi

  10. Proteine di fusione (es. GST, glutatione-S-transferasi)

  11. Immobilized metal ion Affinity Chromatography (IMAC)

  12. Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

  13. Protocollo generale di purificazione proteine

  14. Obiettivi: • Cattura • Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio • Purificazione intermedia • Eliminare la maggior parte dei contaminanti • Polishing • Ottenere la massima purezza possibile

  15. AC: affinity chromatography IEX: ion exchange HIC: hydrophobic interaction chromatography GF: gel filtration RPC: reverse phase chromatography

  16. Desalting

  17. Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi. Cattura e purificazione intermedia mediante IEX

  18. Esempio di cattura mediante HIC

  19. Cattura IEX su resina Q • Purificazione con HIC • Polishing per GF

  20. Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

  21. Schema a blocchi di un gascromatografo

  22. Schema di iniettore

  23. Colonna

  24. Rivelatore a ionizzazione di fiamma

  25. Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria

  26. Accoppiamento di gascromatografo con spettrometro di massa (sorgente a ionizzazione diretta)

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