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Dra. Lúcia Martins Teixeira Instituto de Microbiologia UFRJ

Enterococcus. susceptibilidade. a . antimicrobianos. identificação. e. (e outros gêneros de cocos catalase negativos - relacionados). Dra. Lúcia Martins Teixeira Instituto de Microbiologia UFRJ. Enterococcus Gênero Enterococcus Enterococcus: habitat Enterococcus : patogenicidade

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  1. Enterococcus susceptibilidade a antimicrobianos identificação e (e outros gêneros de cocos catalase negativos - relacionados) Dra. Lúcia Martins Teixeira Instituto de Microbiologia UFRJ

  2. Enterococcus Gênero Enterococcus Enterococcus: habitat Enterococcus : patogenicidade Infecções Enterocócicas Riscos de aquisição de infecção enterocócica Isolamento de enterococos identificação de enterococos e bactérias relacionadas Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Key tests Estudos Taxonômicos em Enterococcus e Gêneros Relacionados Resistência de Enterococcus a Antimicrobianos Enterococcus Emergência de novos perfis e mecanismos de Resistência a Antimicrobianos Resistência a Níveis Elevados Antimicrobial resistance among enterococci causing hospital infections Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos continua índice sair

  3. Métodos de tipagem Métodos de triagem Interpretação de testes Novos antimicrobianos para o tratamento de infecções por VRE Isolamento de VRE a partir da Microbiota Intestinal Estudos epidemiológicos nas infecções enterocócicas Métodos de tipagem de enterococos Ocorrência de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos entre enterococos de origem clínica humana Resistência à Vancomicina em Enterococos no Brasil Emergências Cocos Gram-Positivos Intrinsicamente Resistentes a Vancomicina Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Infecções por Microrganismos Characteristics of patients with urinary tract infections caused by Leuconostoc pseudomesenteroides Clinical sources and diagnosis and/or infections associated with 72 Pediococcus isolates índice sair

  4. Enterococcus sair índice O gênero inclui bactérias anteriormente classificadas como Streptococcus do grupo D Streptococcus faecalis Streptococcus faecium Gênero Enterococcus (1984) Enterococcus sp. em cultura de sangue

  5. Enterococcus sair índice Histórico • 1899,Thiercelin: diplococos Gram +, de origem intestinal • 1906, Andrewes & Holder: Streptococcus faecalis • 1919, Orla-Jensen: Streptococcus faecium • 1933, Lancefield: classificação sorológica estreptococos • 1937, Sherman: piogênicos, láticos, enterococos e viridans • 1970, Kalina:proposta da criação do gênero Enterococcus • 1984, Schleifer & Kilpper-Balz: criação do gênero Enterococcus através de estudo de DNA • 1984- ......: inclusão de várias espécies no gênero

  6. Gênero Enterococcus sair índice E. faecalis Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. faecium Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. avium Collins et al. 1984 E. casseliflavus Collins et al. 1984 E. durans Collins et al. 1984 E. gallinarum Collins et al. 1984 E. malodoratus Collins et al. 1984 E. hirae Farrow & Collins 1985 E. mundtii Farrow, Collins & Jones 1986

  7. Gênero Enterococcus sair índice E. faecalis* Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. faecium* Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. avium* Collins et al. 1984 E. casseliflavus* Collins et al. 1984 E. durans* Collins et al. 1984 E. gallinarum* Collins et al. 1984 E. malodoratus Collins et al. 1984 E. hirae* Farrow & Collins 1985 E. mundtii* Farrow, Collins & Jones 1986 E. raffinosus* Collins et al. 1989 E. solitarius Collins et al. 1989 E. pseudoavium Collins et al. 1989 E. cecorum Williams et al. 1989 E. columbae Devriese et al. 1990 E. saccharolyticus Rodrigues & Collins 1990 E. seriolicida Kusuda et al. 1991 E. dispar Collins et al. 1991 E. sulfureus Martinez-Murcia & Collins 1991 E. flavescens Pompei et al. 1992 E. asini de Vaux et al. 1998 E. haemoperoxiidus Svec et al. 2001 E. moraviensis Svec et al. 2001 E. villorum Vancanneyt et al. 2001 E. porcinus Teixeira et al. 2001 E. ratti Teixeira et al. 2001 E. gilvus Tyrrell et al. 2002 E. pallens Tyrrell et al. 2002 E. phoeniculicola Law-Brown & Meyers, 2002 E. canis De Graef et al. 2002 3 Novas Espécies ........ Carvalho et al. 2004

  8. Enterococcus resistente: habitat sair índice • Trato gastrintestinal • Trato geniturinário • Cavidade oral • Solo, água, vegetais e alimentos • Sobrevive em ambientes contaminados

  9. Enterococcus oportunista : patogenicidade sair índice PATÓGENO HOSPITALAR OPORTUNISTA EMERGENTE E. faecalis : 80-90% das infecções em seres humanos E. faecium : segundo (5-10%), exceto em caso de surtos • Infecções do trato urinário (15%) • Infecções de feridas • Bacteremias(7%) [Endocardites (15-20 %)] • Infecções pélvicas, intra-abdominais Obs: Aparece no ambiente hospitalar: 1960

  10. Infecções Enterocócicas sair índice Comunitária Endógena Aquisição/ Transmissão Origem Exógena Hospitalar

  11. Enterococcus: patogenicidade sair índice FATORES/MECANISMOS DE VIRULÊNCIA Aderência (hemaglutininas; substância de agregação) Citolisinas (hemolisina/bacteriocina) Invasão (substância de agregação; translocação intestinal) Lise dependente do complemento Resistência à lise pelos neutrófilos Resistência a antimicrobianos

  12. Riscos de aquisição de infecção enterocócica sair índice Fatores relacionados com o microrganismo • Distribuição ubiquitária endógena fontes exógena (comunitária e hospitalar) • Marcadores importantes - resistência a phs e temperaturas variados - capacidade de adquirir resistência aos antimicrobianos • Emergência de novos padrões de resistência - resistência a níveis elevados de: aminoglicosídeos, b-lactâmicos, glicopeptídeos • Favorecimento da patogenicidade - vantagens seletivas : - sobrevivência - disseminação

  13. Riscos de aquisição de infecção enterocócica sair índice • Fatores relacionados com o hospedeiro • doença de base grave • hospitalização prolongada (uti; unidades renais, oncológicas) • cirurgia (cardiovascular, abdominal) • cateterização (urinária, venosa) • terapia antimicrobiana prolongada : Cefalosporinas Aminoglicosídeos Fluoro-quinolonas Glicopeptídeos • Fatores Relacionados com o Ambiente Hospitalar • transmissibilidade • pressão seletiva pelo uso de antimicrobianos

  14. Isolamento de enterococos sair índice Seleção do espécime clínico Coleta Transporte Semeadura: Meios Simples Meios Enriquecidos Meios Seletivo-Indicadores

  15. identificação de enterococos e bactérias relacionadas sair índice

  16. Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos sair índice gênero van gás pyr lap be nacl cresc. a: hem 10oc 45oc Cadeias Streptococcus S - -+ - - V V - a/b/n Enterococcus S/R - + + + + + + V a/b/n Vagococcus S - + + + + + (-) V a/n Lactococcus S - + + + V + (-) - a/n Leuconostoc R + - - V V + V - a/n Weissella R + - - V + V V - a/n Abiotrophia S - + + - - - - - a Globicatella S - + - - + - - - a Agrupados e Tetrades Pediococcus R - - + + V - + - a Tetragenococcus S - - + + + - + - a Aerococcus S - + - V + - + - a Gemella S - + V - - - - - a/n Helcococcus S - + - + + - - - n Alloiococcus S - + + - + - - - n Dolosigranulum S - + + - + - - - n Facklamia S - + + - + - - - n Ignavigranum S - + + - + - - - a Moti-lidade

  17. Identificação de enterococos sair índice • Métodos convencionais Identificação presuntiva • Observação da morfologia colonial e padrão de hemólise • Características morfotintoriais • Avaliação fisiológica preliminar: - Catalase - BE - NaCl 6,5% - LAP - PYR - Vanco Caracterização fisiológica • Testes convencionais (bioquímicos e sorológicos) • Sistemas rápidos (API 20S, Rapid Strep) • Sistemas automatizados (VITEK, MicroScan) • Pesquisa de pgmento • Motilidade

  18. Características fenotípicas de enterococcus e gêneros relacionados sair índice Espécies MAN SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIG SAC PIR MGP Grupo I E. E. avium avium + + + + - + + - - - + + - - - - - + - + + + + + E. E. malodoratus malodoratus + + - - + + + - - + + - - + - - - + - + + - + - E. E. raffinosus raffinosus + + + + - + + - + + + - - + - - - + - + + + + + E. E. pseudoavium pseudoavium + + - - + + + - - + - - - - - - - + - + + + + + E. E. saccharolyticus saccharolyticus + + + + - - + - - + + - + - - - - + - + - + - + Grupo II E. faecalis E. faecalis +* - +* - +* - + +* - + - + - - + - - +* - +* + - + - L. L. garvieae garvieae + - + - + - - + - - - - - - - - - v - v - - - - E. faecium E. faecium +* - +* - + + v + + v v - v - - - - +* - +* - - - - E. casseliflavus E. casseliflavus + - + - +* + v + -* +* + -* +* +* + +* + v + v + E. E. mundtii mundtii + - + - + + v + + v + - + - - - + + + + - - - - E. E. gallinarum gallinarum + - + - +* + - +* + - + - + - +* +* - + - + - + - +

  19. Espécies MAN SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIG SAC PIR MGP Grupo III E. durans - - + - - - - - - - - - E. hirae - - + - - v - - - + - - E. dispar - - + - - + - - - + + + Grupo IV E. sulfureus - - - - - + - - + + - + E. cecorum - - - - + + - - - + + - Grupo V E. columbae + - - + + + - - - + + - V. fluvialis + - - - + - - + - + - + Características fenotípicas de enterococcus e gêneros relacionados sair índice

  20. Species MOT PIG MGP EFRO E. faecalis - - - R E. faecium - - - S E. casseliflavus + + + R a a E. mundtii - + - S E. gallinarum + a - + R a a Occasional variant reaction. Key tests, including methyl a -D- glucopyranoside and efrotomycin tests, for the identification of the group II enterococcal species sair índice

  21. Identificação de enterococos sair índice Métodos moleculares • Perfis de proteínas totais • Sondas p/ genes específicos. Ex. Enterococcus GenProbe • PCR para: • D-alanil-D-alanina ligase (E. faecalis e E. faecium) • vanC-1 (E. gallinarum) • vanC-2/3 (E. casseliflavus, “E. flavescens”) • (ITS-PCR) entre 16S e 23S rRNA • Sequenciamento dos genes 16S • Hibridização de DNA

  22. Estudos Taxonômicos em Enterococcus e Gêneros Relacionados sair índice • Caracterização Fenotípica Convencional • Análise dos Perfis de Proteínas (SDS-PAGE) • Hibridização DNA/DNA • Seqüenciamento do genes 16S rRNA

  23. Resistência de Enterococcus a Antimicrobianos sair índice Resistência Intrínseca • Aminoglicosídeos (níveis baixos) • b-lactâmicos (valores de CIM relativamente elevados) • Lincosaminas (níveis baixos) • Trimetoprim-Sulfametoxazol (somente “in vivo”) • Vancomicina (E. casseliflavus, E. gallinarum) Resistência adquirida (plasmídeos e transposons) • Aminoglicosídeos (níveis elevados) • Estreptomicina: ribossômica / adenil-transferase • Gentamicina: acetil-transferase + fosfo-transferase • b-lactâmicos (alteração das PBPs; produção de b-lactamases; tolerância) • Glicopeptídeos ( VanA, VanB, VanD, VanE) • Fluoroquinolonas • Lincosaminas (níveis elevados) • Macrolídeos • Rifampicina • Tetraciclinas

  24. Enterococcus Emergência de novos perfis e mecanismos de Resistência a Antimicrobianos sair índice • Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos • Resistência a Níveis Elevados de b-Lactâmicos • Resistência a Glicopeptídeos

  25. Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos sair índice CMIs > 2000 µg/ml : resistência ao sinergismo Mecanismos de resistência: (plasmídios/transposons): • Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAS) AAC(6’)-Ie + APH(2’’)-Ia AAC(6’)-Ii APH(2’’)-Ib ; APH(2’’)-Ic ; APH(2’’)-Id APH(3’)-IIIa ANT(3’)-Ia ; ANT(4’)-Ia ; ANT(6’)-Ia • Alteração do sítio alvo (Resistência ribossômica/estreptomicina)

  26. Resistência a Níveis Elevados de b-lactâmicos sair índice Modificação das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) • Amostras resistentes à penicilina (E. faecium) têm sido relatadas há décadas (CMIs 8-64 µg/ml) • Amostras resistentes a níveis mais elevados têm sido relatadas com mais freqüência atualmente Produção de b-lactamase • 1981, 1o relato de amostra produtora de b-lactamase • Gene tem localização plasmidial (associado a HLR-GE)

  27. Antimicrobial resistance among enterococci causing hospital infections sair índice Source: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Vancomycin-resistant enterococci 30 25 20 15 Percent Resistance 10 5 0 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Non-Intensive Care Unit Patients Intensive Care Unit Patients

  28. Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus sair índice Fenótipo Van A Van B Van C CMI (mg/ml): Vancomicina 64 - >1000 4 - >1000 2-32 Teicoplanina 16 - 512 0,5 - 1 0,5-1 Expressão Induzida Induzida Constitutiva Localização Plasmídeos Cromossomo Cromossomo dos genes Cromossomo Plasmídeos Genótipo vanA vanB vanC Produtos D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser Espécies E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. avium E. durans E. mundtii E. casseliflavusE. gallinarum

  29. Fenótipo Van D Van E Van G CMI (µg/ml): Vancomicina 64-128 16 16 Teicoplanina 4-64 0,5 0,5 Expressão Constitutiva Induzida ? Localização Cromossoma ? ? dos genes Genótipo vanD vanE vanG Produtos D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser ? EspéciesE. faecium E. faecalis E faecalis Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus sair índice

  30. Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos sair índice TSA para Enterococcus • Importância da Aderência a Padronização • Execução, Controle de Qualidade • Interpretação • Importância de Manutenção Constante de Atualização no Tema • Importância de Avaliação Crítica dos Resultados

  31. Métodos de triagem sair índice Interpretação dos resultados Gentamicina e Estreptomicina: > 1 colônia / cresc. em caldo = resistente O sinergismo obtido entre gentamicina ou estreptomicina e antimicrobianos de ação na parede (ampicilina, penicilina e glicopeptídeos) não ocorrerá. Vancomicina: >1 colônia = resistência presuntiva Realizar testes de motilidade e pigmento para distinguir espécies com resistência adquirida (VanA e VanB) daqueles com resistência intrínseca a níveis intermediários de vancomcina (E. gallinarum, E. casseliflavus)

  32. Métodos de triagem sair índice • Meio de cultura • BHI Agar ou caldo suplementado com: • 500 µg/ml de Gentamicina (agar ou caldo) • 2000 µg/ml (agar) / 1000 µg/ml (caldo) de Estreptomicina • 6 µg/ml de Vancomicina (agar) • Inóculo • Suspensão a partir de um crescimento de 18-24hcom turvação padrão 0.5 McFarland (108 UFC/ml) • “Spot” de 10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (genta e estrepto) • “Spot” de 1-10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (vanco) • Incubação • 24h, 35oC, ar ambiente (Genta e Vanco) • 24-48h, 35oC, ar ambiente (Estreptomicina)

  33. Parâmetro Triagem Triagem Disco Agar Caldo Meio BHI agar BHI caldo MHA Antimicrobiano (conc.) Gentamicina 500 µg/ml 500 µg/ml 120 µg/ml Estreptomicin 2000 µg/ml 1000 µg/ml 300 µg/ml Inóculo 106 CFU/spot 5x104 CFU/0.1ml 0.5 McFarland Incubação (h) 24 24 18 - 24 Leitura > 1 colônia Qualquer > 10mm = susceptível (Interpretação) crescimento 7-9mm = intermediário < 6mm = resistente Métodos de Triagem para a Detecção de Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos (HLR-A) em enterococos sair índice

  34. Métodos de triagem para a detecção de resistência a vancomicina em enterococos sair índice Parâmetro Triagem em Agar Difusão (disco) Meio BHI agar MHA Antimicrobianol (Concentração) 6 µg/ml 30 µg/ml Inóculo 105 - 106 CFU/spot 0.5 McFarland Incubação (h) 24 24 Leitura > 1 colônia > 17mm = susceptível (Interpretação) 15-16mm = intermediário < 14mm = resistente

  35. Interpretação de testes de susceptibilidade para Enterococcus (métodos de difusão e de diluição: NCCLS, 2004; M100-S14) sair índice Diâmetro(mm) CIM (g/ml) Grupo Antimicrobianos S I R S R A Ampicilina (10 g)  17 -  16  8  16 A Penicilina (10 U) 15 -  14  8  16 B Vancomicina (30 g) 17 15-16  14  4  32 Inv Teicoplanina (30 g )  14 11-13  10  8  32 C Eritromicina (15 g)  23 14-22  13  0.5  8 C Estreptomicina (300 g )  10 7 - 9 6 C Gentamicina (120 g )  10 7 - 9 6 C Tetraciclina (30 g )  19 15-18  14  4  16 U Ciprofloxacina (5 g)  21 16-20  15  1  4

  36. Grupos de Agentes Antimicrobianos que devem ser considerados em testes de rotina para Enterococcus sair índice

  37. Novos antimicrobianos para o tratamento de infecções por VRE sair índice Quinupristin-Dalfopristin Associação de estreptogramina B + estreptogramina A (30:70). Tratamento de infecções por E. faecium Van R Aprovado em Dez/1999 Linezolid oxazolidinona Aprovado em Abr/2000 Resistência tem sido documentada em amostras de origem humana e animal

  38. Swab Retal / Fezes 1ml de salina estéril 100ml 1ml de caldo Enterococcosel (BBL) Sem antimicrobiano Vancomicina 6mg/ml 24 - 48hs / 35oC Caldos c/ cor preta TSA + 5% sangue de carneiro Colônias suspeitas Identificação a nível de espécie Isolamento de VRE a partir da Microbiota Intestinal sair índice

  39. Estudos epidemiológicos nas infecções enterocócicas sair índice • Aumento dos casos de infecção enterocócica • Isolamento de amostras com padrões de resistência incomuns • Atipia fenotípica (ex: E. Faecium, raf +, sbl + ou man -, sac -) surto ? • Identificação a nível de espécie de todas as amostras • Triagem da resistência origem ? • Tipagem molecular • Clone único ? • multiclonal ?

  40. Métodos de tipagem de enterococos sair índice Métodos convencionais Métodos moleculares • FenotípicosAnálise dos Perfís de Proteínas Tot.Análise do Polim. Eletr. de Isoenz. • GenotípicosAnálise dos Perfís PlasmidiaisAnálise do DNA cromossômico PFGE RibotipagemReação da Polimerase em Cadeia AP-PCR, RAPD-PCR, Rep-PCR, ITS-PCR, etc .....Sequenciamento MLST • Biotipagem • Resistotipagem • Bacteriocinotipagem • Fagotipagem • Sorotipagem

  41. Ocorrência de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos entre enterococos de origem clínica humana sair índice % 60 Stern et al., 1994 : 39% Merquior et al., 1997 : 55% Carvalho,1998 : 50% Mendonça, 1998: 43% Paula, 2000: 38,5% Mondino et al, 2003: 52,2% 50 40 30 20 10 0 Presente estudo Merquior et al.,1997 Stern et al., 1994 Mendonça, 1998 Carvalho, 1998 Paula, 2000

  42. Resistência à Vancomicina em Enterococos no Brasil sair índice 1996 - Curitiba E. faecium vanD4 • Hemocultura de criança ( F ) portadora de anemia aplásica submetida a transplante de medula. • MICs: Vanco = 256 µg/ml • Teico = 4 µg/ml • HLR-Ge/St 1997 - São PauloE. faecium vanA • Adulto ( F ) com meningite • VRE tornou-se endêmico no hospital • Amostras de VRE passaram a ser detectadas em outros hospitais de São Paulo

  43. Emergência de VRE Rio de Janeiro sair índice • Janeiro 2000  HU-PE / UERJ. Septicemia • Paciente (M 50 anos) com doença maligna hematológica e falência renal • VRE isolado de: • Sangue, fezes, pele e ulcera de decúbito do paciente índice • Fezes de outro paciente na mesma unidade (1/8 - 12,5%) • Fontes ambientais (utensílio para banho: 1/16- 6,2%) • Caracterização: • Enterococcus faecalis vanA; HLR-Ge • MICs: Vanco > 256 µg/ml; Teico = 92 µg/ml

  44. Emergência de VRE Rio Grande do Sul sair índice • Maio 2000  Hospital São Lucas / PUC • Disseminação inter-hospitalar • Enterococcus faecalis vanA • MICs: Vanco = 1024 µg/ml; Teico = 256 µg/ml • Perfis de PFGE relacionados entre si e a clones previamente encontrados

  45. Ocorrências Recentes de VRE Rio de Janeiro sair índice • Rio de Janeiro: • HU-PE / UERJ - Enterococcus gallinarum vanA • Hospital da rede publica - E. faecalis • Hospital da rede privada - E. faecium vanA • Hospitais das redes publica e privada - E. faecium vanA • Niterói: • HU-AP / UFF - Enterococcus faecalis vanA • Hospital da rede privada - E. faecium

  46. sair índice Cocos Gram-Positivos Intrinsicamente Resistentes a Vancomicina : Patógenos Emergentes Enterococcus Leuconostoc Pediococcus

  47. Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos sair índice Gênero VAN GÁS PYR LAP BE NaCl Cresc. a: MOT HEM 10oC 45oC Cadeias Streptococcus S - - + - - V V - a/b/n Enterococcus S/R - + + + + + + V a/b/n Vagococcus S - + + + + + (-) V a/n Lactococcus S - + + + V + (-) - a/n Leuconostoc R + - - V V + V - a/n Pediococcus R - - + + V - + - a

  48. Infecções por Microrganismos do Gênero Leuconostoc em Pacientes Residentes Rio de Janeiro sair índice Sexo, idade paciente Espécie identificada Espécimen clínico Doença subjacente Fatores de risco Aquisição L. Uso de cefalo 3a M, 32a pseudomesenteroides Sangue Hospitalar SIDA geração, SFT cateter IV F, 51a L. pseudomesenteroides Cateter Hospitalar Artrite Cateter IV F, 50a L. lactis Sangue Comunitária - Prótese válvula cardiaca F, 76a L. citreum Sangue Hospitalar Insuficiência Uso de vanco renal e cateter IV L. M, 58a pseudomesenteroides Sangue Hospitalar Insuficiência Uso de vanco renal e cateter IV

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