Nouveaux tests immunologiques pour le diagnostic de la tuberculose Guislaine Carcelain Immunologie Cellulaire, Hôpital

1. Nouveaux tests immunologiques pour le diagnostic de la tuberculose Guislaine Carcelain Immunologie Cellulaire, Hôpital Pitié-Salpêtrière

2. Formes cliniques balance entre le pathogène et les réponses immunes de l’hôte • gouttelettes aérosols dans alvéoles pulmonaires • phagocytose par macrophages alvéolaires, cellules dendritiques • cellules T ganglions drainants Terrain +++ Guérison spontanée Éradication? Primo Infection 5-10% Réactivation 5-15% Infection latente > 90% Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

3. IFNg IL12 CD4 CD8 Tgd CD4-/8- Lyse Mise en place d’une boucle de réponse Th1 Production de molécules anti microbiales : RNI, ROI BK interfère Cl II, Cl I, phagocytose Échappement Persistance en Latence granulone  fusion phagosomes/lysosomes CD4 mémoires effectrices (TEM) Contact récent ag fonction effectrice IFNg rapide CD4 mémoires centrales (TCM) Durée de vie longue>disparition ag prolifération rapide à ag Cellules T spécifiques Contrôlent mΦ infectés Adapté de Kaufmann nature reviews 2001

4. Présentation d’ag mycobactériens Mesure inflammation et induration Hypersensibilité retardée à la tuberculine Réponse Mémoire T aux antigènes mycobactériens + : virage chez non vacciné, >15 mm ou phlycténulaire chez vacciné • La Tuberculine : le plus vieux des antigènes mycobactérien • - Koch’s old tuberculine, 1891 • concentré de culture inactivé par la chaleur • - Tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) • milieu sans protéines, soniqué, filtré, • lots non standardisés • > 200 ag partagés entre M tuberculosis, M Bovis, BGC, certaines M atypiques IDR :non spécifique+++, peu reproductible, peu sensible (< 5 ans, ID …)

5. Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose Alternatives in vitro à l’IDR :mesure de l’IFNg secrété par les cellules T (TEM) en réponse à une stimulation par des antigènes spécifiques Rationnel : si immunisation  fréquence Sang total ou CMNS Ag M Tuberculosis ESAT 6, CFP10 Incubation O/N ou 48h Sécretion IFNg mesure IFNg ELISpot ELISA IFNg pg/ml SFC/106 IGRAs Interferon Gamma Release Assays Adapté de Pai Lancet Infect Dis 2004

6. Facteurs contrôlant leur spécificité • Séquence complète du génome de M Tuberculosis:(S. Cole Nature 1998) - Génome total : 4,4 millions pb • - Gènes codants : 3,9 millions pb soit 90,8% • - Gènes dont la fonction est connue : 2,4 millions pb • Différences entre M Tuberculosis et BCG : Régions de Différence RD • - 129 ORF présentes dans les isolats cliniques de MTb • et absentes dans le génome des souches vaccinales BCG et la plupart des mycobactéries atypiques • - 3 ag immunodominants spécifiques de Mtb codés par RD et inclus dans tests in vitro : ESAT 6/CFP10 (RD1, virulence), TB 7.7 (RD11)

7. Nouveaux tests immunologiques de la tuberculose disponibles dans le commerce, approuvés par la FDA, marquage CE Antigènes (peptides): ESAT-6, CFP10 (RD1), +/- TB7.7 • QuantiFERON-TB Gold in-Tube (Cellestis Limited, Canergie, Australia) • T-SPOT.TB (Oxford Immunotech, Oxford, UK) •  IGRAs :Avantages par rapport à l’IDR : • Pas de seconde visite, résultats en 16-24 heures +/- • Pas de stimulation in vivo des réponses immunes (effet « booster » IDR) • Reproductibilité test et réactifs • Résultat objectif • Spécificité +++ : populations BCG+, infectées par MNT • - Contrôle + : mitogène, met en évidence des faux nég = test in-interprétable

8. Interprétation : 3 résultats possibles  Résultat positif : fréquence élevée de cellules TEM (et Teff) spécifiques de MTb - VP : contage MTb responsable d’une stimulation spécifique de l’immunité mais attention le résultat reste qualitatif : Tuberculose Infection? / Tuberculose Maladie ? infection ancienne? / récente? risque d’évolution vers tuberculose Maladie? - FP : défaut de spécificité Peu probable sauf : M kansasii, M Marinum, M Szulgai …

9. Interprétation : 3 résultats possibles •  Résultat négatif : • fréquence nulle ou faible de cellules TEM et (TEff) spécifiques MTb • - VN : absence de contage tuberculeux • - FN : pb de sensibilité … • . contage tuberculeux ancien? Frces faibles TEM, TE • . stimulation trop brève : délais court pour activer TCM • . choix des antigènes pb CMH certaines éthnies? •  conséquence de ces FN? Risque ou non de réactivation? • augmenter nombre ag? Stimulation plus longue?  Résultat indéterminé : production insuffisante d’IFN-g en présence de PHA Incapacité du SI à développer une réponse T fonctionnelle Comme l’IDR ils peuvent être affectés par l’ID +++ MAIS on le visualise +++ QTF > T-SPOT.TB (ajustement nbre lympho)

10. Pai M, Annals of Internal Medicine 2008 • Spécificité (95% CI) estimée chez le sujet sain • Sujets sains, régions faible endémie, ss ATCD ni exposition à MTb • - QTF-G BCG- 8 études : 0.99% (0.98-1.00) • - QTF-G BCG+ 8 études : 0.96% (0.94-0.98) • - T-SPOT.TB BCG+ 6 études : 0.93% (0.86-1.00) • - IDR BCG- 6 études : 0.97% (0.95-0.99) • - IDR BCG+ 6 études : 0.59% (0.46-0.73) •  Élevée, comparable, > IDR, non modifiée par BCG et peu par MNT • (sf M Szulgai, M marimum, M kansasii …)  Sensibilité (95% CI) estimée chez le patient tuberculeux Sujets tuberculose prouvée, la plupart VIH- • - QTF-G 16 études : 0.78% (0.73-0.82) • - QTF-G IT 6 études : 0.70% (0.63-0.78) • - T-SPOT.TB 13 études : 0.90% (0.86-0.93) • - IDR 20 études : 0.77% (0.71-0.82) •  Inférieure ou égale à celle de l’IDR, (T Mémoires centrales)?

11. IGRAs: rôle dans le diagnostic TB maladie? • - Pas de détection du pathogène … • mis au point pour détecter l’infection par MTb • Possible cependant en situation particulières paucibacillaires: • enfants, formes extrapulmonaires … • (IGRAs Liquide Pleural revues en Joshi R 2008, IGRAs sang (Kim 2008)) • - Mais problématique chez l’adulte : • . un test positif ne fait pas la différence ITL / TBm •  vrai problème en situation endémique • . un test négatif : ne peut éliminer le dg de TBm •  sensibilité non optimale : 80% en situation de TBm

12. IGRAs rôle dans le diagnostic d’une ITL Difficulté: pas de gold standard • dg ITL Sujets exposition forte • Sensibilité variable : QTF-G 44-74% , T-spot.TB 22-100%, IDR 0-90% (revu en Menzies Ann Intern Med 2007) • Association test positif avec le degré d’exposition • Sujets : >20.000clients supermarché Hollandais, contacts employé TB+ • > 17 ans, BGC-, suivi 10 mois, n= 785 IDR et IGRAs, • Monovariée : probabilité IGRAs + corrélée frce shopping, expo cumulée • Multivariée : probabilité IGRAs + corrélée au degré exposition cumulé • alors que pas IDR+++, associée avec âge seulement • (Arend Am J of Resp and Crit care Med 2007) •  % de tests IGRAs positifs évoluant vers TBm ? • Sujets contacts suivis 2ans, sous groupe de sujets non traités TAT : • Evolution TBm : 5/219 (2.3%) IDR+ versus 6/41 (14.6%) QTF+ p< 0.003 • Allemagne (Diel Am J Respir Crit Care Med 2008) • Evolution TBm : 14/843 (1.7%) IDR+ versus 11/649 (1.7%) T-SPOT.TB • Gambie (Hill Plos one 2008)

13. ITL : Prédiction risque de TB active? Rationnel : fréquence TEM, T eff corrélée charge antigénique . Taux élevés IFN-g prédictifs risque développement TBm . Notion d’ récente du taux IFN-g chez patients récemment exposés Seuil maladie seuil infection Adapté de Andersen Trends in Molecular Biology 2007 Guérison initiale ESAT 6- ITL ESAT 6+ Évolution sdaire TBm ESAT 6+  • Forte association risque progression /forte réponse IFN-g ESAT-6 (Doherty J Clin Microbiol 2002) • Risque progression corrélé à intensité des réponses dans un modèle animal (Weldingh Plos One 2008) • Nécessite plus larges études: confirmer ce concept définir seuil, ou delta d’augmentation • définir si ttt selon ce critère  risque TB Difficile +++

14. A-t-on une Réversion de ces réponses ? • Effet du traitement antituberculeux : • - TBm: diminuent sous traitement dès M3, significatif >M28 • - ITL: diminution sous (3-5 mois) ou post traitement (3 mois) • (Carrara 2004, Pathan 2001, Wilkinson 2006, Ewer 2006 …) •  TEM , T eff nécessitent contact récent avec l’ag • disparition ou seuil de réversion? • Mais: discordances (indiv, publications)(revue Pai, Lancet Inf Dis 2007) • - Variabilités individuelles? • - persistance d’une maladie active microbiobiologiquement? … • Evolution spontanée dans le temps de ces réponses : • - Diminution? disparition? Sous l’effet de la «disparition» de l’ag? • - Fluctuations techniques? fluctuations biologiques? • attention réponses seuil +++, variations physio <16%? (Veerapathan 2008) • questions : la reproductibilité (réponses faibles ++), % de • variation bio, signification réversion? définition des seuils de conversion, QTF / TSPOT.TB?

15. Le patient infecté par le VIH • Sensibilité diminuée, cependant : • - Sensibilité IDR très diminuée et faux négatifs • - IGRAs plus sensibles que IDR dans cette population • IDR 47-67% versus IGRAs 63-90% (lagrange 2008, Raby 2008) • T-SPOT.TB moins affecté (Liebeschuetz 2004, Dheda 2005) • - Très modifiée pour QTF par taux CD4/mm3 : • <100 : 23%, 100-199 : 70%, 200-349 : 74%, > 350 : 88% (Raby 2008) • Augmentation des Résultats Indéterminés : - QTF-G 11%,T-SPOT.TB 3%, p< 0.0001 • corrélé à la présence d’un facteur de risque d’ID pour les deux tests • (Ferrara 2005, 2006) • - Supérieur pour QTF-G (11-24%), corrélé taux de CD4 QTF-G++ • (Brock et al. Respir Res 2006) • - T-SPOT.TB plus atteint par déficit fonctionnel que par taux de CD4 • (Dheda et al AIDS 2005, Hoffmann AIDS 2007)

16. Conclusions et perspectivesUn espoir pour avoir mieux que l’IDR ? • Avoir un test plus spécifique :OUI • Avoir un plus sensible : AUSSI sensible • Avoir un test plus reproductible: OUI mais dans quelle mesure? • Avoir un test en un seul temps : OUI mais pas plus rapide • Avoir un test plus corrélé à l’exposition ? OUI • Avoir un test prédictif du risque de progression vers la maladie?OUI probablement mais seuils ou delta de variation à définir Nécessité de larges études pour - Mieux définir l’évolution dans le temps de ces réponses (en cours) - Travailler sur l’aspect reproductible/quantitatif des réponses (en cours) - Evaluer sensibilité tests si «immunodépression» enfants, âgés, ID, (en cours) - Evaluer l’apport de ces tests dans les formes cliniques paucibacillaires - Augmenter la sensibilité des tests et capacité diagnostique (antigènes)