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IV LEZIONE

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATETutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico (~40000 geni)L'espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutaliIn ogni cellula differenziata ed in ogni particolare

Leo
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IV LEZIONE

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Presentation Transcript

    2. ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico (~40000 geni) L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

    3. Restrizione spaziale e temporale dell’espressione genica Geni housekeeping Geni con espressione ristretta nello spazio Espressione in piu’ organi/tessuti diversi Stesso ruolo in piu’ tessuti Il gene codifica per diverse isoforme (promotori alternativi e/o splicing alternativo tessuto specifico) Espressione specifica per tessuto, linea o tipo cellulare Espressione solo in singole cellule Distribuzione intracellulare o extracellulare Geni con espressione ristretta nel tempo Stadio di sviluppo Stadio di differenziamento Momento del ciclo cellulare Espressione inducibile da parte di fattori ambientali o extracellulari REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

    4. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

    5. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

    6. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA POL II PROMOTER ELEMENTS TSS (vicino alla regione Initiator) + sito di legame per un GTF (spesso TBP) CORE PROMOTER ELEMENTS TATA box Initiator Downstream promoter element TRANSCRIPTION FACTORS (TF) BINDING SITES CAAT box GC box Sp-1 sites GAGA boxes ENHANCER(S) SITES

    7. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

    8. Struttura schematica di un promotore per la Pol II

    9. 4 possibili assetti di promotori core funzionali

    10. caaaacggttgacaacatga agtaaacacggtacgatgtaccacat aaagagtattgacttaaagt ctaacctataggatacttacagccat tggcggtgttgacataaata ccactggcggtgatactgagcacatc cgtgcgtgttgactatttta cctctggcggtgataatggttgcatg tgccgaagttgagtattttt gctgtatttgtcataatgactcctgt tctttttgatgcaattcgct ttgcttctgactataatagacagggt cattaacgtttacaatttaa atatttgcttatacaatcatcctgtt cgtcaggattgacaccctcc caattgtatgttttcatgcctccaaa aattgttgttgttaacttgt ttattgcagcttataatggttacaaa atgagctgttgacaattaat catcgaactagttaactagtacgcaa tgttgacaattt t t t tg tataatg c t Due regioni in cui la sequenza e’ conservata: -10 - 35 dallo start site (motivi TTGACA e TATAAT) IL TFIID e’ un complesso della TATA box binding protein (TBP) e di altre proteine chiamate TATA binding protein associated factors, o TAFs. L’inizio della transcrizione puo’ essere studiato in vitro (DNA + proteine purificate). L’inizio della trascrizione da promotori TATA-containing non richiede necessariamente TAFs. TAFs stimulate initiation from TATA-containing promoters that also have Inr's. TAFs are required for initiation from TATA-less promoters. Sequenze nucleotidiche al 5’ del sito d’inizio della trascrizione di geni di E.coli trascritti attraverso il fattore housekeeping sigma70 della RNA polimerasi

    11. I motivi TTGACA and TATAAT sono i segnali che vengono riconosciuti dalla subunita’ sigma70 della polimerasi. La “forza” relativa di un promotore e’ proporzionale alla sua similarita’ ad una specifica sequenza consenso. Mutazioni nelle regioni -10 and –35 alterano la “forza” del promotore. Esperimenti tipo footprinting o methylation interference confermano la loro attivita’. CONSENSUS SEQUENCE APPROACH TO THE IDENTIFICATION OF GENETIC SIGNALS

    12. GENETIC SIGNALS dobefmolecdaiularsqueihgensvweticskiprovsvillmmdescheplemolasusyretpb Gli ELEMENTI SEGNALE generalmente agiscono solo sulle molecole di DNA di cui fanno parte ("cis-acting elements“) Questi elementi segnale vengono “accesi” o “spenti” attraverso l’interazione con fattori di trascrizione I fattori di trascrizione sono PROTEINE. In generale, sono proteine in grado di diffondere nelle cellule e in grado di interagire con elementi bersaglio che possono trovarsi in una qualsiasi molecola di DNA (“trans-acting factors”) dobefmolecdaiularsqueihgensvweticskiprovsvillmmdescheplemolasusyretpb molec ular gen etics pro vi des ple asu re

    13. ESEMPIO DI FATTORE DI TRASCRIZIONE

    14. muscle-type creatine kinase (-1091 –1062) ... ggaggagaagctcgctCTAAAAATAAccct ... alpha-myosin heavy chain (-340 -313) ... cagaTTAAAAATAActaa ... myogenin (-131 –15) ... gcagccggacaagttttgatgcgaggcagcagcttagggtgggct aggtttcctttaggttttctatatttatctctgtgatttaatgccagcgccgg ggtttaaatggcaccgag ... ... Evidenze: DNase I footprinting, direct gel shift, supershift (antibody binding) e methylation protection DATI NOTI: SEQUENZE REGOLATIVE IN GRADO DI LEGARE MEF-2 UPSTREAM AD ALCUNI GENI REGOLATI DA MEF-2

    15. POS. A C G T 01 5 28 25 42 N 02 16 32 31 21 N 03 18 36 27 19 N 04 19 25 33 23 N 05 22 12 43 23 N 06 33 9 21 37 N 07 20 4 43 33 K (G o T, Keto) 08 3 85 3 9 C 09 3 8 0 89 T 10 85 0 0 15 A 11 57 0 0 41 W (A O T, Weak) 12 91 0 1 8 A 13 96 0 0 4 A 14 93 0 1 6 A 15 0 0 0 100 T 16 100 0 0 0 A 17 9 0 90 1 G 18 34 46 11 9 M (A o C, Amino) 19 36 28 8 28 N 20 20 37 15 28 N 21 30 34 13 23 N 22 23 23 22 32 N MATRICE DI MEF-2

    16. SEQUENZE UPSTREAM ALLINEAMENTO LOCALE ANALISI DELL’ALLINEAMENTO PATTERN DISCOVERY MOTIVO METODO

    17. TRANSFAC

    18. TRANSFAC

    21. MODELLO DI ORGANIZZAZIONE DI UN PROMOTORE COMPLESSO RANTES/CCL5 - chemokine – inflammation Promoter characterized

    22. Sono disponibili le sequenze di molti genomi interi Per diversi organismi procariotici ed eucariotici virtualmente tutti i geni sono noti o predetti Informazioni funzionali ancora parziali: regolazione espressione genica funzione proteine L’analisi di singoli promotori con i metodi tradizionali e’ molto lenta e dispendiosa, non “scaled up” alla quantita’ di dati disponibili Applicazione di metodi di “PATTERN DISCOVERY” allo studio di sequenze regolative PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

    23. Perche’ si possono applicare metodi di “PATTERN DISCOVERY” allo studio di sequenze regolative di geni ? E’ verosimile che: gruppi di geni espressi in modo simile (nel tempo, nello spazio) co-regolati ovvero che siano controllati da sottogruppi simili di fattori di trascrizione condividano almeno parte degli elementi regolativi cis-acting, cioe’ i segnali nelle sequenze promotoriali Pattern discovery ? scoprire sottostringhe comuni tra piu’ stringhe (es. Sequenze di DNA) Problemi: I “segnali genetici” non sono pattern esatti ma approssimati Possono esserci o non esserci nelle sequenze analizzate PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

    24. PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI PATTERN MATCHING/RECOGNITION vs PATTERN DISCOVERY PATTERN MATCHING ? trovare TUTTE le volte in cui uno specifico PATTERN esatto si presenta (occurences) in una stringa o in un insieme di stringhe (sequenze di DNA o aminoacidi) Es.: trovare il PATTERN “HHKHKK” in AMVOIBGJFDHHKHKKUUUPFIRJRNTMDHHKHKKHJHKKSAAW PATTERN RECOGNITION ? riconoscere le occurences approssimate di uno specifico PATTERN in una una stringa o in un insieme di stringhe Es.: trovare il PATTERN “HH*HKK” in AMVOIBGJFDHHKHKKUUUPFIRJRNTMDHHAHKKHJHKKSAAW

    25. PATTERN MATCHING/RECOGNITION vs PATTERN DISCOVERY PATTERN DISCOVERY ? identificare PATTERN SIGNIFICATIVI in una stringa o in un insieme di stringhe senza conoscerli a priori Es.: trovare i PATTERN SIGNIFICATIVI in ATTCAGTCTTGTGCTTTTAGTCTCTTAGCTAGTCTCTAATTTAGACAGTCTA Uno puo’ essere: AGTCT, infatti: ATTCAGTCTTGTGCTTTTAGTCTCTTAGCTAGTCTCTAATTTAGACAGTCTA PATTERN DISCOVERY IN SEQUENZE PROMOTORIALI PER LA RICERCA DI NUOVI ELEMENTI FUNZIONALI

    26. Approaches to pattern recognition

    27. Approaches to pattern recognition

    30. Pattern driven: Enumerazione di tutti (o alcuni) dei possibili patterns fino a una certa lunghezza, per ciascun pattern si calcola un punteggio basato sulla frequenza e si scelgono i punteggi piu’ alti Non fattibile per pattern anche di dimensione modesta Sequence driven: ? Ricerca dei pattern basata sull’allineamento delle sequenze Approaches to pattern discovery

    31. I metodi "pattern driven" cercano in una sequenza specifiche classi di pattern e valutano la loro frequenza di apparizione. Il numero di pattern possibili aumenta esponenzialmente con la lunghezza dell'input. Per pattern esatti, ad esempio, e' quadratico. L'utilizzo di una struttura di dati ad albero dei suffissi migliora l'efficienza del metodo e permette di trovare tutte le sequenze piu' (o meno) rappresentate dell'atteso in tempo lineare con la dimensione dell'input Algoritmi pattern driven

    32. Algoritmi pattern driven

    33. Per calcolare quanto un fenomeno sia sorprendente ci si riferisce a quello che ci si aspetta, sotto un’ipotesi probabilistica. La frequenza attesa di una sottostringa dipende dalla composizione della stringa. se %G=%C=%A=%T=25% posso immaginare una sorgente casuale che crea delle stringhe in modo che la probabilita’ di osservare un certo nucleotide in una certa posizione e’ indipendente dalla sequenza precedentemente generata (Modello di Bernoulli) A ATGCTGT T sempre 25% G C Approccio enumerativo: ? enumerare tutti i possibili pattern di una certa lunghezza contenuti in una stringa ? calcolare la significativita’ statistica di ciascuno ? prendere in considerazione i pattern piu’ significativi Pero’ esistono 410 (1,048,574) possibili pattern lunghi 10 in un alfabeto di 4 nucleotidi

    36. Algoritmi sequence driven

    37. LAVORO “SPERIMENTALE” ANALISI BIOINFORMATICA E COMPUTAZIONALE DELLE SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI NELLA RETINA

    38. LAVORO “SPERIMENTALE” ANALISI BIOINFORMATICA E COMPUTAZIONALE DELLE SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI NELLA RETINA DATI: SEQUENZE DI DNA A MONTE DI GENI RETINA-SPECIFICI >NM_000539.2 rhodopsin (opsin 2, rod pigment)(RHO)chr3:147548167-147549166 exons in upper case CCTTCAGACTGGAGTCCCCTGAAGGGTTCTGCCCCTCCCCTGCTCTGGTAGCCCCCTCCATCCTCCCTCCCTCCACTCCATCTTTGGGGGCATTTGAGTCACCTTTCTACACCAGTGATCTGCCCAAGCCACTGCTCACTTTCCTCTGGATAAAGCCAGGTTCCCCGGCCTAGCGTTCAAGACCCATTACAACTGCCCCCAGCCCAGATCTTCCCCACCTAGCCACCTGGCAAACTGCTCCTTCTCTCAAAGGCCCAAACATGGCCTCCCAGACTGCAACCCCCAGGCAGTCAGGCCCTGTCTCCACAACCTCACAGCCACCCTGGACGGAATCTGCTTCTTCCCACATTTGAGTCCTCCTCAGCCCCTGAGCTCCTCTGGGCAGGGCTGTTTCTTTCCATCTTTGTATTCCCAGGGGCCTGCAAATAAATGTTTAATGAACGAACAAGAGAGTGAATTCCAATTCCATGCAACAAGGATTGGGCTCCTGGGCCCTAGGCTATGTGTCTGGCACCAGAAACGGAAGCTGCAGGTTGCAGCCCCTGCCCTCATGGAGCTCCTCCTGTCAGAGGAGTGTGGGGACTGGATGACTCCAGAGGTAACTTGTGGGGGAACGAACAGGTAAGGGGCTGTGTGACGAGATGAGAGACTGGGAGAATAAACCAGAAAGTCTCTAGCTGTCCAGAGGACATAGCACAGAGGCCCATGGTCCCTATTTCAAACCCAGGCCACCAGACTGAGCTGGGACCTTGGGACAGACAAGTCATGCAGAAGTTAGGGGACCTTCTCCTCCCTTTTCCTGGATCCTGAGTACCTCTCCTCCCTGACCTCAGGCTTCCTCCTAGTGTCACCTTGGCCCCTCTTAGAAGCCAATTAGGCCCTCAGTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAGCTTAGGAGGGGGAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGTCAGAACCC >NM_000172.1 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha transducing activity polypeptide 1 (GNAT1)chr3:55664892-55665891 AAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCAGGCACGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGACTGAGACCATCCTGGCTAACACGGTGAAACCCTGTCTTTACTAAAATACAAAAAAAGTAGCCCGACGTAGTGGCGGGCACCTGTTGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCTGGGAGGTGGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGAGCAACAGAGCGAGACTCCATCTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAGACACATACACCGAGGCACACAGAGCAGATATGCATGCCCACCACAGTCCGCTGGAAGCAGAGGACCTCCTTGGGGCAGCTCCAGCCTGTGATATGGGATGAATGCAATGCCCACTGTTTCCCTCTCTCTGGATTCCCTGCAGGTCATAAAATCCCAGTCCAGAGTCACCAGCCCTTCTTAACCACTTCCTACTGTGTGACCCTTTCAGCCTTTACTTCCTCATCAGTAAAATGAGGCTGATGATATGGGCATCCATACTCCAGGGCCAGTGTGAGCTTACAACAAGATAAGGAGTGGTGCTGAGCCTGGTGCCGGGCAGGCAGCAGGCATGTTTCTCCCAATTATGCCCTCTCACTGCCAGCCCCACCTCCATTGTCCTCACCCCCAGGGCTCAAGGTTCTGCCTTCCCCTTTCTCAGCCCTGACCCTACTGAACATGTCTCCCCACTCCCAGGCAGTGCCAGGGCCTCTCCTGGAGGGTTGCGGGGACAGAAGGACAGCCGGAGTGCAGAGTCAGCGGTTGAGGGATTGGGGCTATGCCAGCCCGATTAGAAGGGTTGGGGGGGCTGAGCTGGATTCACCTGTCCTTGTCTCTGATTGGCTCTTGGACACCCCTAGCCCCCAAATCCCACTAAGCAGCCCCACCAGGGATTGCACAGGTCCGTAGAGAGCCAGTTGATTGC >NM_021200.1 PH domain containing protein in retina 1 (PHRET1) chr11:78311616-78312615 CACAAAGAAATGTAAAAGTTACTTGTTGGCTTATTAGTCTCAATAAGTTTTAGTTGATTGAACAAACAAAGTCTCTCACAGCCAGGACTGCTGCGGCTGGAATTCCTGACATACTGTCATACCTCTCACTCGTCAATCTACACTCTCCTCCCATCTACACAGCTCTGGAAATTAAAAACAATCCAACCATGACTATCATGGCTTCAGAGGTCTATGAACTCCCAGGAATTATACGCAGATTTTTTCCTGAGGACAGTCTACACTTCCTTATTGGCTTCTCAAAGAGGGTCACTGACCAGCTTTTAGAGACATGGGCCAAGTCCGGCTACGTTTAGATTCGGTAGTAGTGTCTGTGGTTTTAGTTTGCCACGTCCTTTCCTCTTTTTTTCGTCATAGTGCCCGCTCTTTGGGAGGTAGGGGAGAGTCTTCCCCTGAAGTCTCCACTGCTGCTGGAGAACCTTCCTTTTTCATCTGGTTGCTAAATCCAGAGAATGAAATCTAGGAGATGATTGCACCGTCCCCGCCCCTCAACATGAAGGATGCCCCACTGCCCATCGGGGAGGGGAGCAGGGAGAGCTGGAGAGAGGCTGGGTCGGGGCAGGACCCAGGCGCAGATCCTCCGAGGCCAGCTGCAGCCCTACCTACCTGCCTTCCCCTCTTTCCCCTCCCTTCTTTTCTCCTTCTGTCTTTCCTTCCTTCCATATCTCTTTCCTTGCCTCTTTCCCCCTCCCACTGCTTCCTTTCTTCCTTCCACTGTGGAGGTGGAAAATTTAGCTAGGAGAAGCTGGGACTGGGACGTTCCAGGAACCAGACAGAGAGTGAGTTAAAGGCACAGAGATGAAAACGCGGTTTGGGAGAGCTGGTTCTTGAGTCGGCTAAGAGGGGATGAACTCAATGGTTAATAGGATTGGCCATGGCGAATCCCTCAGCAGGGCACGCACCGCACAAAGGGCCGAAGCGCGAGGGTAGCTCGAGGTCAGGATTACAGAGACTCAGGAGC

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