INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA

1. INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA Sylvia V. Copaja C. Semestre Otoño 2007

2. ELECTROFORESIS CAPILAR (EC) La electroforesis capilar en un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. En electroforesis capilar se emplean capilares norrow-bore 20-200 µm DI para realizar separaciones de alta eficiencia tanto para moléculas grandes como pequeñas. Estas separaciones son facilitadas por el uso de altos voltajes, los cuales generan flujos eléctricos y electroforéticos de soluciones buffers y especies iónicas.

3. Las propiedades de la separación son una mezcla entre la electroforesis tradicional y la HPLC. • Características de la electrofresis capilar: • Utiliza tubos capilares similares a las columnas capilares de GC • Alta fuerza eléctrica > 500 V/cm • La señal se denomina Electroferograma • Pequeña cantidad de muestra • - Versátil

4. Fácilmente automatizable Consume pequeña cantidad de reactivo Instrumentación El instrumento utilizado es relativamente simple, necesita un capilar de sílica fundida, una fuente de poder de alto voltaje, dos electrodos, dos reservorios para la solución buffer y un detector UV u otro.

6. El final del capilar es colocado en los reservorios con el buffer y una ventana es alineada con el detector. En EC los componentes de una mezcla se transportan a través de un tubo capilar dispuesto horizontalmente (o parcialmente enrollado) por efecto de un elevado potencial de corriente continua que se aplica a lo largo de la longitud del tubo. Esta nueva técnica se denomina actualmente electroforesis capilar (CE), o electroforesis capilar de alta resolución (HPCE).

7. Teoria: • Terminología en electroforesis • Hay pocas diferencias de terminología entre la cromatografía líquida y la electroforesis capilar. • Sin embargo algunos términos fundamentales deben ser definidos: • Tiempo de migración tm – es el tiempo que toma al soluto moverse desde el comienzo del capilar hasta la ventana del detector.

8. - Movilidad electroforética, uep (cm2/Vs) - Velocidad electroforética, vep (cm/s) - Fuerza del campo eléctrico, E (V/cm) La relación entre ellos es : vep Ld/tm uep = ---------- = ---------- (1) E V/Lt

9. - Las velocidades pueden ser calculadas dividiendo el tiempo de migración (tm) por la longitud del capilar (Ld) - Las movilidades son determinadas dividiendo la velocidad por la fuerza del campo eléctrico. - La movilidad es independiente del voltaje y la longitud del capilar, pero es altamente dependiente del tipo de solución buffer utilizada, del pH y la temperatura.

10. Dos longitudes del capilar son importantes. • La longitud hacia el dectetor Ld y la longitud de todo el capilar Lt. • Mientras la separación medible ocurre en el segmento del capilar Ld, la fuerza es calculada dividiendo el voltaje por la longitud de todo el capilar Lt. • - La ecuación (1) es útil sólo para la determinación de la movilidad aparente. Para calcular la movilidad real, es necesario considerar el flujo electroosmótico.

11. Flujo electroosmótico Este fenómeno es una consecuencia de la superficie cargada en las paredes del capilar. Los capilares que se utilizan para las separaciones tienen grupos silanoles ionizables en contacto con la solución buffer contenida en él. El grado de ionización es controlado por el pH del buffer El flujo electroosmótico se produce por la doble capa eléctrica que se desarrolla en la interfaz entre la sílice y la disolución.

12. La cargas negativas provienen de la disociación de los grupos funcionales que constituyen la sílice fundida. Esta carga atrae los iones positivos de la solución reguladora, originando una estructura de doble capa eléctrica. Los iones positivos móviles que rodean la superficie interior del tubo son atraídos por el electrodo negativo arrastrando con ellos a las moléculas de disolvente. Una característica única del flujo electroosmótico es que posee un perfil de flujo casi plano.

13. En lugar del parabólico como es el caso cuando se impulsa un líquido a través de un tubo por presión hidrostática. Tal como se muestra en la siguiente figura. Debido a que el perfil del flujo es casi plano, el flujo no contribuye de manera significativa al ensanchamiento de la banda cromatográfica.

15. Fundamento de la separación Las separaciones electroforéticas se originan por diferentes movilidades de los solutos. La movilidad electroforética es proporcional las fuerzas de fricción o retraso, que dependen de la forma y tamaño de las especies de analito, así como la viscosidad del medio. Las propiedades del disolvente como, la fuerza iónica, pH y la constante dieléctrica, influyen sobre la carga efectiva del soluto, forma y tamaño hidrodinámico.

16. Las especies cargadas positivamente se mueven a lo largo del capilar con una velocidad que es mayor que la del flujo electroosmótico, puesto que su movimiento se ve acelerado por la atracción del electrodo negativo. Las especies negativas se mueven más lento debido a la repulsión del electrodo negativo.

17. CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPTLC) La cromatografía de capa fina TLC se asocia normalmente a un procedimiento muy simple para la separación de una mezcla de sustancias en sus componentes constitutivos La selectividad, como criterio de separación, es medida a través del factor de retardo Rf La simplicidad de esta técnica cromatográfica y su asociación al análisis cualitativo han atentado en sus contra en la necesaria difusión en los distintos campos de aplicación La principal diferencia entre columna y capa fina en términos simples es que una constituye un sistema cerrado y la otra un sistema abierto, diferencia básica que determinará las ventajas y desventajas de una y otra

18. Una ventaja importante en la HPTLC es que permite el desarrollo cromatográfico separado de la detección y cuantificación, situación que le imprime, frente a otras técnicas (GC, HPLC) características de flexibilidad, versatilidad y adaptabilidad, especialmente ventajosas en análisis de rutina Objetivos La eficiencia lograda a través de la optimización de los distintos parámetros en la HPTLC tiene como objetivos lo siguiente: El logro de una buena separación La separación del máximo de componentes en una determinada mezcla

19. La detección y la cuantificación de componentes en concentraciones lo más baja posible, incluso en presencia de concentraciones significativamente altas de otros componentes La perfecta dosificación en la cantidad de muestra aplicada evitando los problemas tales como efecto cola y efecto borde comúnmente asociados a grandes volúmenes de aplicación (sobrecarga) El logro de máxima precisión en el análisis cromatográfico cuantitativo La adquisición del máximo de información utilizable de los componentes separados a fin de minimizar los problemas de identificación y de falsos positivos

20. Minimizar el tiempo de análisis Minimizar el gasto de reactivos La máxima reproducibilidad, afectada principalmente por la humedad, saturación de la cámara, modificación de la mezcla de disolventes de desarrollo y la temperatura El factor de retardo de un soluto es: distancia recorrida por el analito Rf = ---------------------------------------------------------------------- distancia recorrida por una sustancia de referencia dR Rf = ------ dM

21. Donde dR (muestra) y dM (disolvente) son las distancias lineales medidas desde la línea de aplicación El factor de capacidad Se necesita relacionar dR y dM con tR y tM, que en este caso corresponden a los tiempo necesarios para que la fase móvil y el soluto recorran una distancia determinada, en este caso dR El tiempo de residencia del soluto en la fase móvil es igual a la distancia que recorre dividido por la velocidad lineal del disolvente, μ, o tM = dR/μ Sin embargo, el soluto no alcanza este punto hasta que la fase móvil no ha recorrido la distancia dM, asi tR = dM/μ

22. Sustituyendo dM - dR K’ = ---------------- dR El factor de capacidad k’ se puede expresar en funcion de Rf 1- dR/dM 1 - Rf K’ = ---------------- = -------------- dR/dM Rf Alturas del plato (dR)2 N = 16 ---------- H = dR/N (w)2

26. Indicadores y medidas de la eficiencia del proceso Un criterio de la eficiencia de la HPTLC es el grado de separación lograda para 2 manchas cromatográficas, lo que se expresa en términos de resolución (Rs) De la ecuación queda en manifiesto que la Resolución, se puede mejorar aumentando la separación ΔX o disminuyendo los diámetros promedios d1 y d2 de las manchas cromatográficas

27. Para aumentar ΔX, se debe mejorar la selectividad del sistema, aumentando las diferencias en las velocidades de migración de los componentes. Esta selectividad, que el TLC viene dada por los valores de Rf, está determinada por Estructura de los poros del adsorbente Modificación del soporte (adsorbente) Densidad del empaquetamiento Composición de la fase móvil En la optimización de parámetros cromatográficos se deben considerar parámetros de entrada y de salida

28. Entre ellos: - material constituyente de la capa adsorbente - el disolvente o mezcla utilizados como fase móvil - el método de desarrollo cromatográfico - el reactivo utilizado como revelador para la identificación del cromatograma - el reactivo utilizado para la interacción a fin de producir derivados cromóforos o fluoróforos En forma cuantitativa se puede modificar - la proporción de los disolventes - la cantidad de muestra aplicada - la distancia origen-frente de disolvente - la cantidad de reactivos por unidad de área en la detección - la temperatura de desarrollo - el espesor de la capa adsorbente

29. el tamaño de partículas del adsorbente Los parámetros de salida Identificación - posición de la mancha Rf - cambios en la posición de la mancha por interacción con algún reactivo agregado (ΔRf) - color de la mancha cromatográfica luego de la aplicación del reactivo revelador Cuantificación - Diámetro de la mancha m(d) - Área bajo la curva obtenido por barrido espectrofotométrico de la mancha cromatográfica

30. Fases estacionarias y sistemas de aplicación Fase estacionaria Como soporte se utiliza: vidrio, folios de aluminio o folios plásticos Como fase estacionaria gel de sílice hidrofílico con superficie no polar de 2, 8 y 18 átomos de carbono, el más usado es la sílice octadecilsilanizada, también se utiliza celulosa acetilada. Otras fases son ciano, nitrilo, fenil, diol, etc. Las placas se llaman nanocromatoplacas. Sistemas de aplicación Lo más importante es la reducción de volúmenes 50-200 nL y de 1-2 mm de diámetro

31. Desarrollo cromatográfico Los aspectos críticos en el desarrollo cromatográfico son: - como introducir el disolvente de desarrollo a la placa - como controlar en proceso de los factores ambientales (evaporación o cambio en la composición)