Molecular Pathology introduction 分子病理学导论

1. Molecular Pathologyintroduction分子病理学导论 汕大医学院病理教研室 苏　敏

2. Pathology What are the specific changes in function and structure that characterize each disease? Level A.Naked eye level: gross changes in diseased organs. Level B.Light microscopic level: in histological and cytological level. Level C.Electron-microscopic(EM) level: in the ultrastructure (cellular organelles). Level D.Molecular level: inspect aberrant in DNA, RNA, and protein.

3. 第一节 绪言 分子病理学(molecular pathology)是在蛋白质和核酸水平，应用分子生物学技术研究疾病发生发展过程中的一个病理学分支学科。 通常人们将所有的生物分子分为两类: 1. 水、无机盐、碳水化合物和寡核苷酸等的小分子，分子量一般小于500D; 2. 生物大分子，体内最重要的生物大分子即蛋白质和核酸，它们是生命体结构和功能的核心物质。

4. 分子病理学的核心内容是通过对蛋白质和核酸等生物大分子的结构、功能及其相互作用等规律的研究来阐明生命的分子基础，从而探索生命和疾病乃至生与死的奥秘。分子病理学的核心内容是通过对蛋白质和核酸等生物大分子的结构、功能及其相互作用等规律的研究来阐明生命的分子基础，从而探索生命和疾病乃至生与死的奥秘。 就病理学的学科体系而言，凡是传统病理学涉及的领域，如疾病的病因、发病机制、病理变化、转归及相应的功能代谢变化，都是分子病理学的研究内容和对象。

5. 第二节 细胞核、遗传物质分子病理学 一、细胞核与遗传物质 （一）细胞核 • 有核膜包围的细胞核是真核细胞区别于原核细胞的最主要特征，在光镜下细胞核中可见核仁结构。 • 由真核细胞组成的生物称为真核生物，包括单细胞生物（如酵母）、原生生物、动植物及人类等。

6. （二）细胞核与遗传信息储存结构 真核细胞与原核细胞在结构上存在很大差异。真核细胞与原核细胞在基因组（genome）组成上的差异主要有三个方面： • 真核细胞含有更多的DNA，DNA是遗传信息的携带者，所以，真核细胞比原核细胞蕴藏着更多的遗传信息。此外，真核细胞的DNA不成环状，而呈线状并被包装成高度凝集的染色质结构； 2. 真核细胞的细胞器也含DNA，在线粒体中含有少量的DNA,可编码线粒体tRNA、rRNA和组成线粒体的少数蛋白；

7. 3.原核细胞的mRNA转录与蛋白质翻译同时进行，即边转录边翻译，无需对mRNA进行加工，但真核细胞的mRNA在合成之后，必须在细胞核内经过剪接加工，然后运输到细胞浆中翻译成蛋白，即DNA在细胞核中，储存遗传信息的DNA是以与蛋白质结合形式存在，并被包装成为高度有序的染色质结构。3.原核细胞的mRNA转录与蛋白质翻译同时进行，即边转录边翻译，无需对mRNA进行加工，但真核细胞的mRNA在合成之后，必须在细胞核内经过剪接加工，然后运输到细胞浆中翻译成蛋白，即DNA在细胞核中，储存遗传信息的DNA是以与蛋白质结合形式存在，并被包装成为高度有序的染色质结构。 4. 转录与翻译分开进行。

8. (引自WWW.DXY.cn)

9. (引自WWW.DXY.cn)

10. 二、 细胞核与疾病 （一）基因病 • 人类疾病的发生发展直接和间接地与基因密切相关。因此，可以认为人类的疾病都是基因病。正因为如此，人们一直不遗余力地寻找某基因和某疾病的对应关系。

11. 基因病可分为三大类： 1.单基因病：由单个基因缺陷引发。常遵循经典孟德尔遗传定律：一些表现为常染色体显性遗传，如短指、马凡氏征、眼睑下垂征等。有些表现为常染色体隐性遗传，如白化病、先天聋哑等。还有一些致病基因位于性染色体上，呈现性连锁遗传，如红绿色盲。

12. 马凡氏征

13. 白化病

14. 2．多基因病：涉及多个基因缺损。缺损基因之间可有相互作用，也可能有主次之分，也可能受环境的影响,并常出现家族倾向。2．多基因病：涉及多个基因缺损。缺损基因之间可有相互作用，也可能有主次之分，也可能受环境的影响,并常出现家族倾向。 属于复杂遗传病（complex genetic disease） 如糖尿病、心血管疾病、各种肿瘤等。 与简单的单基因疾病相比,复杂性状疾病的形成,是许多微效基因的加和作用。在这些不同基因构成的遗传背景中,可能存在主要易感性基因(majorgene)。 除此之外,基因是否发挥作用和基因作用的最终结果(表型),还要受环境因素的制约。

15. 因此,如果要阐明这类疾病的发病机制,需要解决两个问题: （1）定位克隆疾病易感性基因。 • 绝大多数疾病的发生是众多微效的、低外显率的易感基因相互作用以及它们与环境因素相互作用的综合结果。 • 鉴定疾病易感基因，目前有关的主要理论为：每种疾病都存在相对应的一组变异等位基因（包括多态性），而且这些基因变异在人类祖先或某些人群祖先就发生了。因此，采用高通量技术，结合遗传分析方法，有可能从疾病患者基因组中一个个地找出相应的变异等位基因。

16. 疾病相关基因定位和克隆的常用方法 • ①定位克隆 • ②候选基因关联分析。 以序列标记（突变、微卫星、SNP等）为筛查标记，根据疾病患者组与匹配对照组出现频率的显著性差异，从候选基因中筛出易感基因。这是目前最常用的方法。

17. 疾病相关基因定位和克隆的常用方法 单倍型（haplotype）关联分析 单倍型（haplotype）关联分析。据新近单倍型作图（haplotype mapping）结果表明，人类基因组中含有12万个单倍型域（haplotype block），每个域平均长度为25kb,加起来正好覆盖整个基因组，而每个域最多横跨1个目标基因。因此，可以单倍型域为靶标，进行全基因组扫描，寻找与疾病易感性相关的单倍型域，找到了单倍型域，也就找到了相应的易感基因。

18. 人类基因组单体型图（Haplotype map, 以下简称HapMap）计划是人类基因组研究领域的第二个重大战略目标。 • 其主要内容是对亚、非、欧裔全基因组中DNA序列上的多态位点进行测定和分析，由此构建出整合了人类遗传多态信息的每条染色体的“单体型图”。

19. 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性,频率大于1%。 • SNPs在人类基因组中广泛存在,并通常以二等位基因的形式出现,便于进行大规模和高通量分析,因此是继限制性酶切长度多态性(RFLP)和微卫星之后的第三代遗传标记。

20. SNP最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而成为研究复杂疾病、药物敏感性及人类进化的重要标记。至今在人类基因组中已有五百多万个SNP位点被确定。SNP最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而成为研究复杂疾病、药物敏感性及人类进化的重要标记。至今在人类基因组中已有五百多万个SNP位点被确定。 • 如果每一个对群体或个体的研究项目都要对所有样品中即使是基因组中的一部分序列的每一个SNP位点进行检测、鉴定，其费用将是极为惊人的昂贵。 • 由此，在人类基因组计划协作组基础上建立的“HapMap计划”国际协作组提出了人类基因组研究的第二个战略任务，即再次以多国分担合作的形式，共同构建整合了人类全基因组遗传与变异信息的单体型图。

21. HapMap的科学基础是染色体上的SNP的“板块”（block）结构。HapMap的科学基础是染色体上的SNP的“板块”（block）结构。 • SNPs在一段染色体上是成组遗传的，在DNA上构成无形的区域---“板块”。 • 每个板块在进化上非常保守，在多世代的传递中没有或极少发生DNA重组，其SNPs的构成在单个染色体上的模式，即单体型（Haplotype，图1）。 • 不同个体的DNA序列上的差异因而可以准确的用SNP的始祖板块或单体型表示。

22. 特别是，对于一种单体型来说，只需几个位点作为其标签（tag）SNPs，便可知道整个单体型的模式。特别是，对于一种单体型来说，只需几个位点作为其标签（tag）SNPs，便可知道整个单体型的模式。 因而在检测上只要对几个标签SNPs而无需对所有的位点进行检定，便可确定一个“板块”的单体型。 对不同族群SNP单体型的研究还表明，人类基因组中的每一板块或单体型一般只有几种类型。 由此绘出揭示人类遗传多态信息的“单体型图”，从全基因组规模大大简化以后的SNP分型研究，为疾病相关的遗传多态研究提供SNP标签位点。

23. 图单体型图示意。a 一段DNA上的SNP位点。来自4个不同个体的相同染色体区域的这一段DNA的大部分序列完全相同但有3个位点表现出差异。每个SNP有两个可能的等位位点（alleles），第一个SNP的可能等位位点是C和T。b 单体型。一个Haplotypes由临近的一系列SNP等位位点组成，图中显示从一个6000 bp DNA片断上检定出的20个SNPs的排布类型，包括a中的3个位点（第二排箭头），大多数人群的染色体均显示有Haplotypes 1-4。c 标签SNPs。只要检定分型20个SNPs中的3个，就足以确定这一段序列的单体型。例如，如果测出一个染色体的3个标签SNPs是A - T –C，则这一序列是单体型1。（转引自The International HapMap Consortium. The International HapMap Project, Figure 1. Nature, 2003；426）

24. 通过表型与全基因组SNPs图谱的相关研究,理论上可将人类的任何表型、功能、对任何疾病的易感性加以定位,从而对疾病遗传机制的阐明做出重要贡献。通过表型与全基因组SNPs图谱的相关研究,理论上可将人类的任何表型、功能、对任何疾病的易感性加以定位,从而对疾病遗传机制的阐明做出重要贡献。 • 然而，即使找到了疾病易感基因和特异性分子表型，也不等于阐明了疾病发生发展的分子作用机理。最终阐明机理尚需进一步搞清楚：该疾病易感基因涉及哪些信号传导通路？ • 这些信号传导通路之间如何发生作用和影响？疾病易感基因在这些信号传导通路内是如何发挥作用及是否与信号传导通路之外的分子发生作用？

29. 什么是 HapMap

30. HapMap是人类基因组中常见遗传多态位点的目录，它描述了这些变异的形式、在DNA上存在的位置、在同一群体内部和不同人群间的分布状况。HapMap是人类基因组中常见遗传多态位点的目录，它描述了这些变异的形式、在DNA上存在的位置、在同一群体内部和不同人群间的分布状况。 • HapMap计划并不是利用HapMap中的信息来建立特定的遗传变异与某一疾病之间的联系，而是为其他研究者提供相关信息使之能够将遗传多态位点和特定疾病风险联系起来，从而为预防、诊断和治疗疾病提供新的方法。

31. 我们细胞中的DNA是由四种基本化学“构件”——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）所组成的长链。人类细胞中的23对染色体就是由多于60亿个这种化学单位排列而成。我们细胞中的DNA是由四种基本化学“构件”——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）所组成的长链。人类细胞中的23对染色体就是由多于60亿个这种化学单位排列而成。 • （见“http://www.dnaftb.org/dnaftb/上的遗传学基本知识”）。这些遗传序列包含的信息可以影响我们的身体性状、罹患疾病的可能性以及身体对遇到的外界物质的反应。

32. 不同人的遗传序列极为相似。若比较两个人的染色体，他们的DNA序列上可以连续数百个核甘酸都是相同的。不同人的遗传序列极为相似。若比较两个人的染色体，他们的DNA序列上可以连续数百个核甘酸都是相同的。 • 然而，平均约每1200个碱基就会有一个核甘酸的不同（图1）。在一个位点上某人是A，另一个人却有可能是G；或者某人在特定的位点上多出或者缺失一些碱基或DNA片段。 • 染色体上每一个不同的“拼写”被称作一个等位位点（allele），一个人染色体上的所有等位位点的集合就是基因型。

33. 图1：当比较两个随机个体的7号染色体上的一段DNA序列时，图1：当比较两个随机个体的7号染色体上的一段DNA序列时， 在2200个核甘酸中出现两个单核甘酸多态位点（SNPs）。

34. 不同个体的碱基的差别是目前最常见的遗传多态现象，这些遗传上的差别称为单核苷酸多态性或SNPs（发音为“snips”）。不同个体的碱基的差别是目前最常见的遗传多态现象，这些遗传上的差别称为单核苷酸多态性或SNPs（发音为“snips”）。 • 国际人类基因组单体型图计划通过识别在人类基因组中常见的大约一千万个SNPs的大多数，来确定人类的大部分遗传多样性的分子基础。

35. 对遗传学家来说，SNPs也是进行基因定位的分子标记。比如说基因上一个拼写的改变会增加罹患高血压的风险，对遗传学家来说，SNPs也是进行基因定位的分子标记。比如说基因上一个拼写的改变会增加罹患高血压的风险， • 但是研究者们并不知道这个基因在染色体上的位置。他们可以比较高血压患者和正常人的SNPs。 • 如果某一个SNP在高血压患者中很常见，就可以把这个SNP作为标记来定位和识别与这一疾病相关的基因。

36. 然而，检测人类染色体上所有的一千万个常见SNPs的费用极其昂贵。然而，检测人类染色体上所有的一千万个常见SNPs的费用极其昂贵。 • HapMap的构建将使得遗传学家可以利用SNPs及其它遗传上的变异在染色体上的组成特点。 • 一些相互邻近的多态位点趋向于在一起共同遗传。例如，对于所有那些在某一位点是A而不是G的人来说，该位点周围染色体区域上的SNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型

37. 图2：HapMap的构建分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样品中鉴定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有图示的四个单体型中的哪一个。

38. 在人类染色体的很多区域中，只发现了少数的几种单体型 。在一个特定人群中，55％的人可能拥有同一种单体型，30％的人可能拥有另一种单体型，8％的人可能拥有第三种单体型，而其余的人可能拥有若干种稀有的单体型。 • HapMap计划将鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识别这些单体型的标签SNPs。通过检测个体的标签SNPs（该过程称为基因分型）， • 研究者就可以鉴定一个人的单体型的集合。估计包含了大多数遗传变异的模式信息的标签SNPs的数量大约是30万至60万，远远少于一千万个常见SNPs。

39. 一旦从HapMap中获得标签SNPs的信息，研究者将能利用它们来定位与重要医学特征相关的基因。一旦从HapMap中获得标签SNPs的信息，研究者将能利用它们来定位与重要医学特征相关的基因。 • 假设研究者想要找到与高血压相关的遗传变异，他并不需要确定一个人的所有SNPs的类型，而只须对少得多的标签SNPs进行基因分型就可以得到一个人的单体型的集合。 • 研究者可以集中研究可能与疾病相关的特定候选基因，也可以纵观整个基因组来找到与疾病相关联的染色体区域。如果高血压患者都倾向于具有一个特别的单体型，与该疾病相关的变异位点很可能就在这个单体型内部或邻近区域。

40. 单体型的起源

41. 人类基因组中的单体型源于人类有性生殖的分子机制和我们作为一个物种的历史。 • 除性细胞外，染色体在人类细胞中成对出现。其中一条染色体来自父方，另一条来自母方。但染色体在一代代的传递过程中并不是一成不变的。 • 在精子和卵细胞形成的过程中，染色体对发生重组，即一对染色体中聚集到一起并交换片段。由此产生的杂合染色体含有这对染色体的两个成员的片段，并传递给下一代。

42. 多代之后，经过反复的重组事件，祖先染色体的片段的原有排布在非近亲结婚的人群中已被打乱。多代之后，经过反复的重组事件，祖先染色体的片段的原有排布在非近亲结婚的人群中已被打乱。 • 某些祖先染色体片段会在许多后代个体的DNA序列中出现（图1）。这些是没有被重组打破的区段，相互间被那些发生了重组的区域隔开。 • 这些区段就是单体型，遗传学家利用它可以寻找与疾病或者其它医学上的重要特征相关的基因。

43. 图1：图示两个祖先染色体经过多代的重组拼接产生不同的子代染色体。如果祖先染色体上的一个多态位点（用X作为标记）会增加罹患某种疾病的风险，当代的两个遗传了祖先染色体的带X标记部分的个体也会增加这种风险。被X标记的变异附近有许多SNPs可以用来定位此处变异。

44. 解剖学上的现代人类始祖居住于15万年前的非洲，化石记录和和遗传证据表明现在所有的人都起源于此。解剖学上的现代人类始祖居住于15万年前的非洲，化石记录和和遗传证据表明现在所有的人都起源于此。 • 因为人类是一个相对年轻的物种，任何现代人群的大多数变异都来自于祖先中就已经存在的多态性。 • 当人类走出非洲的时候，他们带走了部分而不是全部的祖先的遗传多态性。因此，非洲以外的单体型可以看作是非洲单体型的子集。 • 非洲以外的人类的单体型比非洲人的单体型更长，因为非洲人有更长的历史，也就有更多的重组来打破单体型。

45. 随着现代人遍布到世界各地，由于随机性、自然选择和其它的遗传机制，各个地区的单体型频率也变得不同。随着现代人遍布到世界各地，由于随机性、自然选择和其它的遗传机制，各个地区的单体型频率也变得不同。 • 一个已知的单体型在不同人群中会出现不同的频率，特别是那些分布广泛而且在婚配过程中不可能发生大量DNA交换的人群。 • 另外，DNA序列新的变化（即突变），也可以产生新的单体型，大多数这种新近产生的单体型没有足够的时间传播到其他的人群和地区。

46. 如何解释伦理学问题？

47. 国际HapMap计划引起一些已有的和新提出的伦理学问题。通过初期的设计考虑以及遗传学家与伦理学家之间持续的密切合作，项目已经解释了这些伦理问题。 • 项目中用到的个体DNA样品被标识为男性或女性，以及来自于四个参与人群中的哪一个群体；三体家系样品中还标识出是来自于父亲、母亲还是孩子。样品中牵涉到识别个人的信息是隐匿的，任何样品中都没有私人信息。 • 另一个安全措施是每个参与人群收集到的样品数都多于研究所需，因此无人知道某个人的DNA是否用在研究当中。同时，捐赠者的医学或表现型（phenotype）信息也不在收集范围之内。

48. 由于这些样品不包括任何个人标记，危及捐赠者个人隐私的风险也就降至最低。由于这些样品不包括任何个人标记，危及捐赠者个人隐私的风险也就降至最低。 • 然而，因为可以确定某个样品是来自哪一个人群[见“HapMap出版和介绍中关于项目取样群体的指导方针 ”]，使用HapMap进行的研究可能会产生对群体的歧视。 • 例如，研究者可能会发现与某种疾病高风险相关的一个遗传变异在某个人群中比在另一个人群中更为常见，而这个信息可能被错误地解释为该人群中的每个人都有患这种疾病的高风险，即使这种高风险只出现在那些拥有这个变异的人身上，而不论这些人是否属于这个人群。

49. 同样，遗传学上的发现可能会破坏已有的文化或宗教传统、法律状况和政治次序。同样，遗传学上的发现可能会破坏已有的文化或宗教传统、法律状况和政治次序。 • 很多民族对自己的起源及其与其他民族的关系都有坚定的信仰，这些信仰也许会受到使用HapMap带来的新发现的挑战。 • 另外，遗传学上的发现可能会与群体已经建立的自我认同的社会和文化方式相冲突。

50. 最后，这一计划的结果可能会被错误解释为象“种族”这样的概念含有准确和属于具高度生物学意义的范畴的意味。最后，这一计划的结果可能会被错误解释为象“种族”这样的概念含有准确和属于具高度生物学意义的范畴的意味。 • 事实上，这一项目得到的信息有助于阐明种族的形成很大程度上是源于社会和文化的相互作用，而与生物学的祖先仅有松散的联系这一普遍观点。