P l a n t Improvement Biotechnology

1. P l a n t Improvement Biotechnology by

2. เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology) เทคนิคใดๆก็ตามที่นำเอาสิ่งมีชีวิต หรือชิ้นส่วนของสิ่งมีชีวิตมาพัฒนา หรือปรับปรุงผลิตภัณฑ์ ปรับปรุงพืช, สัตว์ หรือจุลินทรีย์เพื่อใช้ประโยชน์โดยเฉพาะ

3. พันธุวิศวกรรม (Genetic engineering หรือrecombinant DNA technology) เป็นเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับการตัดต่อ gene หรือสารพันธุกรรม เพื่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลง ทางลักษณะพันธุกรรมของพืช, สัตว์ หรือจุลินทรีย์

4. GMOs(genetically modified organisms) สิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม เป็นสิ่งที่มนุษย์สร้างขึ้นด้วยเทคนิคพันธุวิศวกรรม (genetic engineering) # GMO บางครั้งใช้ LMO

5. L M O (Living Modified Organism) LMOเป็นความมีชีวิตของสิ่งมีชีวิตใน ขณะที่ GMOรวมไปถึงผลิตภัณฑ์ที่เกิด ขึ้นในสภาพที่ไม่มีชีวิต เช่น อาหารGMO

6. Plant genetic engineering วิธีการตัดต่อ geneหรือสารพันธุกรรมของพืช เพื่อให้มีการเปลี่ยนแปลง ลักษณะทางพันธุกรรม พืชที่ผลิตได้จากวิธีนี้ เรียก พืชแปลงพันธุ์ หรือ พืชจำลองพันธุ์ (Transgenic plants)

7. พืชแปลงพันธุ์? เป็นพืชที่มีการดัดแปลง ตกแต่งสารพันธุกรรม (genetically modified)โดยได้รับการส่งถ่ายยีน จากสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันหรือ ชนิดอื่น ทำให้มี ลักษณะตามต้องการ

8. ความหมายของการส่งถ่ายจีนสู่พืชความหมายของการส่งถ่ายจีนสู่พืช กระบวนการส่งถ่ายยีนที่สนใจ (gene of interest) เข้า สู่พืช ไม่จำเป็นต้องเป็นยีนจากพืชเสมอไป ยีนที่ส่งถ่ายเข้าไปต้องสอดแทรกกับโครโมโซมของพืช อย่างเสถียร ผ่านขั้นตอนการแบ่งเซลล์ แบบ Mitosis และ Meiosis

9. การสร้างพืชแปลงพันธุ์การสร้างพืชแปลงพันธุ์ 1 การเตรียมพืชสำหรับการส่งถ่าย gene การเตรียม gene(การ clone DNA) การส่งถ่าย geneให้กับพืช การตรวจสอบการแสดงออกของ gene การเพิ่มปริมาณพืชแปลงพันธุ์ 2 3 4 5

10. การ clone DNA 1. เตรียม DNA พาหะที่บริสุทธิ์ 2. ตัด DNA พาหะที่จุดจำเพาะด้วย restriction enzyme 3. เตรียม DNA ที่ต้องการจะ clone แล้วตัดด้วย restriction enzyme ชนิดเดียวกับที่ตัด DNA พาหะ 4. สร้าง DNA ลูกผสม (recombinant DNA ; rDNA) ในหลอดทดลอง โดยเชื่อมชิ้น DNA พาหะกับชิ้น DNA ที่ต้องการจะ clone ด้วยDNA ligase (DNA ligation) 5. เคลื่อน DNA ลูกผสม (rDNA) เข้าสู่เซลล์ให้อาศัย ในหลอดทดลอง 6. คัดเซลล์ให้อาศัยที่มี DNA ลูกผสมที่ต้องการ

11. DNAพาหะ(Vector DNA) Plasmid เป็น DNAเกลียวคู่ รูปวงแหวน พบอยู่ใน bacteria ใน plasmid จะมีส่วนเริ่มต้นของการ replication (origin of replication)ทำให้สามารถถ่ายแบบได้อย่างอิสระ นอกจากนี้ plasmidบางชนิดยังมี antibiotic resistant gene อยู่ทำให้เซลล์ให้อาศัย (host cell)ที่มี plasmid เหล่านั้น อยู่สามารถเจริญได้ในที่มี antibioticนั้นๆ

12. DNA ที่ใช้ในการ clone 1. Genomic DNA 2. Complementary DNA (cDNA) 3. DNA ที่สังเคราะห์โดยวิธีทางเคมีสังเคราะห์ oligonucleotide ขนาด 100 nucleotide โดยใช้เครื่องสังเคราะห์อัตโนมัติ 4. DNA ที่ได้จากการเพิ่มปริมาณโดยปฏิกิริยา DNA polymerase chain reaction

13. การส่งถ่าย gene ให้กับพืช (การสร้างพืชดัดแปลงพันธุกรรม) การส่งถ่าย gene เข้าสู่พืชใช้วิธี 1. Agrobacterium mediated gene transfer 2. Direct gene transfer

14. Agrobacterium @ เป็น bacteria แกรมลบชนิด aerobic bacteria ที่อาศัยอยู่ในดิน @ เป็นสิ่งมีชีวิตชนิดแรกที่ก่อให้เกิดการส่งถ่ายยีน ตามธรรมชาติหรือก่อให้เกิดพันธุวิศวกรรม ตามธรรมชาติ (Nature’s first genetic engineering) @ จัดอยู่ใน Family Rhizobiaceae

15. Agrobacteriumชนิดที่สำคัญคือ 1. A. tumefaciens ก่อให้เกิดโรค crown gall 2. A. rhizogenesก่อให้เกิดโรค hairy root

16. ภายในเซลล์ Agrobacteriumมี extrachromosomal plasmidขนาดใหญ่ประมาณ 200 kbp. @ ใน A. tumefaciens มี Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) @ ใน A. rhizogenesมี Ri plasmid (root inducing plasmid)

17. Ti plasmid Ri plasmid

18. Ti plasmid บน Ti plasmid จะมี 2 บริเวณที่มีความสำคัญ ต่อการส่งถ่ายยีนสู่พืช คือ 1. T-DNA (transfer DNA) 2. Vir region (virulence region)

19. T-DNA (transfer DNA) ประกอบด้วย DNAประมาณ 23 kb ขอบเขตของ DNA(DNA border) กำหนดด้วย terminal repeat ประมาณ 25 bp ซึ่งเรียกว่า left border (LB) และ right border (RB) บริเวณ LB และ RB มีความ สำคัญ คือทำหน้าที่เป็น “recognition signals for transfer system”

20. # นอกจากนี้บน T-DNA มีรหัสสำหรับการสร้าง enzyme ที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์สาร opine, ออกซินและไซโตไคนิน # Opine เป็นแหล่ง C และ N ที่ Agrobacteriumจะนำ ไปใช้ ตัวอย่างสาร opine เช่น octopine และ nopaline

21. แสดงแผนที่ของ T-DNA ของ Agrobacterium

22. แสดง gene ที่กำหนดการสร้าง auxin และ cytokinin

23. การเกิด Crown gall เมื่อ A. tumefaciensบุกรุก (infect) พืชตรงบริเวณที่มีบาดแผล จะทำให้เกิด crown gall หรือเนื้อเยื่อปุ่มปมขึ้นที่ลำต้น รูปสรุปกระบวน การส่งถ่าย gene สู่พืชโดย Agrobacterium

24. พืชเกิดบาดแผล ปลดปล่อยสารในกลุ่ม pheonolic compound Agrobacterium เคลื่อนที่แบบ chemotaxis Pheonolic cpd. กระตุ้นการทำงานของ vir gene T-DNA สอดแทรกเข้า Plant genome Crown gall tumor

25. การสร้างพืชแปลงพันธุ์การสร้างพืชแปลงพันธุ์ • มีเวคเตอร์นำ gene ที่สนใจเข้าสู่พืช • มีการรวมตัวของ gene และโครโมโซมพืช • มีการรวมตัวแบบเสถียร สามารถผ่านขั้นตอน • การแบ่งเซลล์ได้ • gene ที่ส่งถ่ายเข้าไปถูกถ่ายทอดได้โดยการ แบ่งเซลล์

26. การสร้างพืชแปลงพันธุ์การสร้างพืชแปลงพันธุ์ การใช้ Agrobacteriumพา gene ที่ตัดแต่งเข้าไปในเซลล์พืช

27. โครงสร้างของยีน (gene construct) ที่เป็นส่วนประกอบหลักของ GMOs

28. การส่งถ่ายจีน Tobacco mosaic virus เข้าสู่พืชโดย Agrobacterium (Raven and Johnson, 1995)

29. kiwifruit sugarbeet rapeseed turnip-rape Brassica napus B. juncea B. oleracea papaya cucumber melon chrysanthmum carnation strawberry soybean ตัวอย่างพืชแปลงพันธุ์ที่ได้จากการใช้ Agrobacterium

30. Cotton sunflower walnut flax tomato alfalfa tobacco Pea popular plum Prunus armeniaca potato pepino grape vine ตัวอย่างพืชแปลงพันธุ์ที่ได้จากการใช้ Agrobacterium (2)

31. Direct gene transformation Polyethylene Glycol Microprojectile , microprojectile bombardment, particle gun Electroporation Microinjection Ultrasonication

32. Microprojectile (Raven et al., 1995)

33. Microinjection (Raven et al., 1995)

34. การส่งถ่ายจีนทั้งสองวิธี (Raven et al., 1995)

35. Brassica napus (rapeseed) Brassica oleracea Dactylis glomerata (cockfoot) Fragaria x ananassa (strawberry) Glycine max (soybean) Lactuca sativa (lettuce) Orysa sativa (rice) Zea mays (maize,corn) Festuca arundiancea (tall fescue) Avena sativa (oats) Carica papaya (papaya) Gossypium hirsutum (cotton) Picea glauca (white spruce) Populus (poplar) Triticum aestivum (wheat) ตัวอย่างพืชแปลงพันธุ์ที่ได้จากการส่งถ่ายจีนโดยวิธีตรง

36. ประโยชน์ของการสร้างพืชแปลงพันธุ์ (GMOs) 1. ทำให้เกิดพืชสายพันธุ์ใหม่ที่ต้านทานต่อโรค เช่น ต้านทาน ต่อ virus โดยส่งถ่าย gene ที่กำหนดการสร้าง coat protein gene (CP) ของ virus เข้าไปในพืช 2. ทำให้เกิดพืชสายพันธุ์ใหม่ที่ต้านทานต่อแมลงศัตรู เช่น ส่งถ่าย gene พวก bt gene (Bacillus thuringiensis) เข้าสู่พืช 3. สร้างพืชต้านทานต่อสารกำจัดวัชพืชเช่นต้านทาน ต่อ glyphosate

37. Herbicide resistance tobacco (Raven et al., 1995)

38. 4. สร้างพืชพันธุ์ใหม่ที่มีลักษณะที่ต้องการ เช่น * สร้างพืชที่ทนต่อดินเค็ม * สร้างพืชทำให้คุณค่าทางอาหารเพิ่มขึ้น, * สร้างพืชพันธุ์ใหม่ที่สามารถตรึง N2ได้ * ดอกไม้หรือไม้ประดับสายพันธุ์ใหม่ที่มีรูปร่าง แปลกกว่าเดิม ขนาดดอกใหญ่กว่าเดิม ถือเป็น quality trait

39. Belive it or not?

40. 5. สร้างพืชที่สามารถเก็บไว้ได้นานโดยไม่มีปัญหาเรื่องการสุก ในระหว่างการขนส่ง เช่น สร้างมะเขือเทศที่สุกช้าลงโดยการ ส่งถ่าย gene พวก antisense ACC synthase และ ACC oxidase ทำให้ผลิต ethylene ช้าลง มะเขือเทศสุกช้า สามารถเก็บไว้ได้นาน