Specijalni mikroskopi

1. Specijalni mikroskopi Dubravka Krilov 06.11. 2003.

2. Optički mikroskopi • 2 tipa optičkih mikroskopa: • Transmisijski – svjetlost iz izvora prolazi kroz preparat, ogiba se i ulazi u objektiv • Refleksijski – preparat se obasjava sa strane i samo raspršena svjetlost ulazi u objektiv

3. Specijalni optički mikroskopi – povećanje kontrasta • Kvaliteta slike ovisi o rezoluciji i kontrastu (razlikovanje na temelju varijacije intenziteta propuštene svjetlosti) • Biološki preparati su disperzni sistemi u vodi – kontrast je vrlo slab • Poboljšanje: • 1. bojenje dijelova preparata (amplitudni preparat) • 2. razlika optičkih puteva uzrokuje razliku faza (fazni preparat) – pretvara se u razliku intenziteta • 3. fazni pomak ogibnih snopova iskorištava se za postizanje različite osvjetljenosti preparata i pozadine • 4. primjena fluorescencije (prirodne i obilježavanja fluorescentnim probama - konfokalni mikroskop • 5. refleksijska tehnika – ogibna slika • 6. upotreba UV svjetlosti

4. broj valova na putu L je različit u otapalu i preparatu: razlika faza izlaznih valova tu razliku faza pretvaramo u razliku intenziteta - interferencija valova koji prolaze kroz preparat i onih koji prolaze oko njega Interferencijski mikroskop not 1 1 l0 2 2 npr l’ l L

5. Izvedba interferencijskog mikroskopa snop koji ne prolazi kroz preparat snop kroz preparat

6. jajašca i spermiji morske alge snimljeni interferencijskim mikroskopom

7. konični snop zraka ogiba se na preparatu i na leći fazna pločica u stražnjoj žarišnoj ravnini objektiva pomiče razliku faza 0-tog i ostalih ogibnih maksimuma s l/4 na l/2 zbog destruktivne interferencije slika preparata je tamna strukture unutar preparata zbog dodatne razlike faza dobro se uočavaju Fazno-kontrastni mikroskop

8. bakterije protozoe Mikroorganizmi snimljeni fazno- kontrastnim mikroskopom

9. Konfokalni fluorescentni mikroskop(pretraživački; laserski snop) • Laserski snop se fokusira na malo područje • Uzorak je fluorescentan • Reflektirana i fluorescentna svjetlost se razdvajaju zrcalom • Apertura ispred detektora propušta fluorescentnu svjetlost samo iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva • Velika rezolucija • Mogućnost rekonstrukcije 3D slike

10. GFP (green fluorescent protein) se vezuje na receptore za glukagon Jezgre bubrežnih stanica embrija - plava boja se vezala na DNA endosomi (crveno), GFP-receptor (zeleno) nakon tretmana bubrežnih stanica, receptor iz membrane migrira u citoplazmu hepatokarcinoma stanice snimila Lada Krilov

11. bubrežne stanice embrija tretirane glukagonom (glukagonski receptor fluorescira zeleno) snimila Lada Krilov

12. Transmisijski elektronski mikroskop (TEM)

13. Izvedba TEM mikroskopa • Molekula bacitracina - TEM slika X 10,000,000 X 20,000,000

14. Pretraživački elektronski mikroskop - SEM • lošija rezolucija (dmin = 10 nm) • 3D kvaliteta slike dobiva se upotrebom struje sekundarnih elektrona kojom moduliramo ‘osvjetljenost’ slike plankton

15. kad je proba vrlo blizu površine javlja se struja tuneliranja, It koja se detektira varijacijom položaja probe tako da se It održava konstantna, dobiva se reljef površine - vizualizacija pojedinačnih atoma potreban je vodljiv uzorak – ograničena biološka primjena na uzorke koji se mogu obložiti ugljikom ili platinom “Scanning tunneling” mikroskop (STM)

16. “Atomic force” mikroskop (AFM) • između vrha probe i uzorka djeluju privlačne Van der Waalsove sile koje primiču konzolu uzorku • na velikoj blizini, odbojne sile savijaju konzolu unatrag • registracija - preko reflektiranih laserskih snopova koji padaju na niz fotoćelija • mjerenje sile vezivanja, na pr. ligand-receptor