Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában

1. Kapilláris elektroforézisMikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam

2. Elválasztástechnika • Kromatográfia (1903) МихилЦвет • (Ultra)centrifugálás (1908 / 1926) Theodor Svedberg • Elektroforézis (1930 / 1948) Arne Tiselius • Tömegspektrometria (1897)

3. Tiselius elektroforézis készüléke

4. Gélelektroforézis (urea jelenlétében) Vasmentes és vassal telített transferrin minták. 6%T, 3%C; 100 V, 8°C. Futtatási idő 17 óra.

5. Zónaelektroforézis kapillárisban urea jelenlétében --- --- --- ---

6. A kapilláris elektroforézis kezdete • Stellan Hjertén (1958) - „free zone electrophoresis” 1-3 mm kvarccső • Franz Everaerts (1970-es évek eleje) – ITP (Kendall, 1923!) • Rauno Virtanen (1974) - potenciometrikus detektálás, ZE • F.E.P. Mikkers (1979) - zónaelektroforézis tefloncsőben • J. Jorgenson (1981) - zónaelektroforézis, EOF !

7. Elektroforetikus rendszer Hjertén, 1958

8. „Free zone electrophoresis” (Stellan Hjertén, 1967)

9. Az első „kapilláris elektroforézis” készülék Stellan Hjertén, 1967

10. A vándorlás sebessége elektromos térben • v sebesség • m mozgékonyság, mobilitás (mobility) • E elektromos térerő • U alkalmazott feszültség • l az elválasztó rendszer (ellenállással rendelkező) hossza

11. Elektromos mozgékonyság (mobility) Elektroforetikus vándorlás ideális (híg) oldatokban A vándorlás a töltés/tömeg hányadostól és a viszkozitástól függ

12. Az elektroforézis közege oldat  papír  gél  oldat 1930 1950 1955 1967

13. A poliakrilamid mátrix előnyei • majdnem teljesen ideális, áramlásmentes közeg • felbontó képessége nagy • a diffúzió csökkentett • viszonylag éles zónákban történik a komponensek vándorlása

14. A szabad oldatban történő elektroforézis előnyöket eredményez, de „következményekkel jár” elektroendozmózis

15. Az elektromos kettősréteg az üveg felületén

16. Kettős réteg • elektródok felületén • kolloid részecskék felületén

17. Az endozmótikus áramlás mozgékonysága a vákuum dielektromos állandója az oldószer dielektromos állandója viszkozitás „zéta potenciál”

18. Elektroendozmótikus áramlás (endosmotic flow)

19. Az áramlási profil hatása a zóna-szélességre A kialakuló folyadékáram dugószerű profilt mutat.

20. Az endozmózis függése a pH-tól

21. Kationok és anionok vándorlása elektroozmózis jelenlétében [cm2 V-1 s-1] (1 Tiselius egység = 10-5 cm2V-1s-1)

22. - EOF + Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében

23. Pozitív, semleges és negatív komponensek elektroforézise Benziltrimetilammónium kloridot (1), benzil-alkoholt (2), acetilszalicilátot (3), 4-hidroxibenzoátot (4) és benzoátot (5) tartalmazó mintaoldat elektroferogramja (Körülmények: kapilláris: 57 cm x 75 μm, térerősség: 263 V/cm, T=25C, =200 nm, puffer: 50 mM foszfát, pH=7,0.)

24. Fedett kapillárisban a gélelektroforézishez hasonló körülmények • „Coated capillary” • Metilcellulóz • Nem keresztkötött poliakrilamid • Szénhidrátok AZ EREDMÉNY  nincs elektroendozmózis !

25. A kapilláris elektroforézis gyakorlata • Automatizálható • A kapillárist „kondícionálni” kell/lehet • Kapilláris bevonat alkalmazható („coating”) • Mintabevitel többféle módon lehetséges • A tápegység detektorhoz közel eső pólusa földelt • Változatos futtatási körülmények (környezeti paraméterek) • puffer-adalékok • Többfajta elválasztási elven működő rendszer • Változatos detektálási módszerek (egy ponton, teljes hosszban) • Kiértékelés, kalibráció

26. A kapilláris elektroforézis készülék 2-100 mm „fused silica” kapilláris Állandó hőmérséklet (0 - 60 °C) UV detektor Nagyfeszültségű tápegység 0-30 kV Minta és elektrolit-tartályok

27. Kapilláris elektroforézis (1995)

28. Chip-kapilláris elektroforézis készülék (2005)

29. Kvarc-kapilláris és mikrochip

30. A detektálási módszerek érzékenysége • Direkt módszerek • UV-látható fényelnyelés 10-13-10-16 mol • Fluoreszcencia 10-15-10-17 mol • Lézer-indukált fluoreszcencia (LIF) 10-18-10-20 mol • Amperometria 10-18-10-19 mol • Vezetőképesség 10-15-10-16 mol • Tömegspektrometria 10-16-10-17 mol

31. Az elektroforézis módszerei • Osztályozás az elválasztás elve alapján

32. Az elektroforetikus elválasztás fajtái (1) Zóna elektroforézis (ZE - CZE) Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF) Izotachoforézis (ITP - CITP) Gélelektroforézis (PAGE - CGE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján előre megformált pH gradiensben A vándorló komponensek mobilitása (m) alapján SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján

33. Az elektroforetikus elválasztás fajtái (2) Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján Az elektroendozmózis jelenlétében vándorló komponensek és a kromatográfiás álló fázis kölcsönhatása alapján

34. Zóna elektroforézis (ZE - CZE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján történő elválasztás Megfelel a nem-denaturáló gél-elektroforézisnek

35. - EOF + Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében

36. Szérum-elektroforézis • Normál szérum kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 70.6 g/l, albumin-tartalom 42.7 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 20 kV; 200 nm, 20 °C. A minta higítási aránya 1:50.

37. Liquor-elektroforézis • Normál liquor kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 0.42 g/l, albumin-tartalom 0.23 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 25 kV; 200 nm, 20 °C. A minta nem volt higítva.

38. Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF) Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján, előre megformált pH gradiensben történő elválasztás

39. pH gradiens formálása amfolitokkal • amfoter tulajdonság • szintetikus vegyületek keveréke (> 4000 féle molekula különböző izoelektromos ponttal) • jó pufferkapacitás • >0 vezetőképesség az izoelektromos pontnál

40. Izoelektromos fókuszálás (isoelectric focusing)

41. Transzferrin-formák detektálása 280 nm-en a fehérjemennyiség detektálható, 460 nm-en a vassal telített fehérjemennyiség detektálható Az egyes transzferrin izoformák izoelektromos pontja közötti különbség kisebb, mint 0.3 pH egység

42. Hemoglobin formák analízise izoelektromos fókuszálással normál Hb minta Hb variánsok Hb minta diabéteszes betegtől

43. Izotachoforézis (ITP - CITP) A vándorló komponensek mobilitása (m) alapján történő elválasztás

44. Izotachoforézis (isotachophoresis) A vándorló komponensek a mobilitásuknak (m) megfelelő sorrendben vándorolnak az elválasztás után (azonos sebességgel) mzáró-ion<mC-komponens <mB-komponens <mA-komponens<mvezető-ion

45. Uraemiás beteg széruma izotachoforetikus koncentrálás nélkül nem vizsgálhatók a kóros mennyiségben felgyülemlő savak

46. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján, azaz a molekulák hidrofóbicitása alapján történő elválasztás

47. Micellaképződés • A felületaktív anyagok egy bizonyos koncentráció-érték felett micellákat képeznek. • CMC - kritikus micella koncentráció (cSDS = 8 mM) • „SDS” - > a dodecil-szulfát anionok micellákat képeznek, amelyekben a poláris oldószer felé helyezkednek el a szulfát-anion csoportok, és a micella magját az apoláris, hidrofób láncok alkotják

48. Micellar elektrokinetic chromatography (Shigeru Terabe, 1985) Micellákat tartalmazó elektrolitban a micellába belépő hidrofób komponensek, hidrofóbicitásuknak megfelelően rövidebb-hosszabb ideig a micellával együtt vándorolnak az elektromos térben.

49. Töltéssel nem rendelkező anyagok elektroforetikus/elektrokinetikus analízise A dodecil-szulfát micellák segítségével 14 mono- és diszaccharid elválasztása lehetséges nagy felbontással, mennyiségi analízis céljára is. A cukrok jelölve voltak a detektálhatóság érdekében

50. Gélelektroforézis (PAGE - CGE) Miután a kapillárisban nem szükséges hordozó mátrix, ezért a gélelektroforézist csak az ún. denaturáló formában alkalmazzuk molekulasúly meghatározásra, vagy DNS analízisre. Fehérjéket SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján lehet elválasztani a gél-pórusokon való átvándorlás akadályozottsága miatt Nukleinsavakat / oligonukleotidokat is molekulaméret szerint választhatunk el