I materiali biologici per l’esame colturale: tipologia ed importanza di un corretto prelievo

1. I materiali biologici per l’esame colturale: tipologia ed importanza di un corretto prelievo Diagnostica Microbiologica delle Infezioni delle Basse Vie RespiratorieFirenze, 13 Marzo 2007 A. Raglio, A Grigis A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo U.O. Microbiologia e Virologia Direttore Dott A. Goglio

2. I temi • Il problema • Il nemico • L’importanza di un corretto prelievo • I materiali biologici • Criteri di idoneità

3. IL PROBLEMALa polmonite acuta è fra le prime sei cause di morte ed è la più comune causa di mortalità correlata a infezione(Mandell 99)Tanti quadri cliniciTanti patogeniTanti materiali biologiciPoche diagnosiSolo nel 20-50% delle polmoniti comunitarie si riesce a raggiungere una diagnosi eziologicaMancanza di:- standardizzazione- test di riferimento (gold standard)

4. CAP: Principali patogeni isolati in corso di differenti studi di sorveglianza 60 S. pneumoniae H. influenzae 50 Legionella 40 Gram negativi nessun patogeno % 30 20 10 0 Rello 1996 Moine 1994 Feldman 1995 28/01

5. IL NEMICO28 Batteri28 Virus10 Funghi 2 Rickettsie 5 Mycoplasmi e Chlamydie 5 Parassiti Mandell, Infectious Diseases, Fourth Edition

6. I microbi del cavo orale - Flora endogenadel cavo orale:10 15 1. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0

7. Flora naso-orofaringea Opportunisti (raramente patogeni)- Str. - emolitici- S.coag.negativi- neisseriacee- Candide- Haemophilus spp- Actinobacillus spp- Anaerobi-………... Normalmente non presenti: - BGN (ferm. e non) - Enterococchi -……. Ma nei pz intubati sì

8. Flora naso-orofaringea Patogeni (stato di portatore sano)- S. aureus 35-40 %- N. meningitidis 5-15 %- S. pneumoniae 0-50 %- Haemophilus influenzae 5-20 %-………...

9. Infezioni comunitarie Infanti-bambini:-> 80% virali:Influenza, RSV, adenovirus,…..- altre: Haemophilus, S. pneumoniae, S.aureusAdulti giovani:-> batteriche:M. pneumoniaeAdulti e anziani:- < 10-20% virali- altre:S. pneumoniae, Haemophilus, S.aureus e BGN fermentanti e non

10. Polmonite ospedaliera o nosocomiale -La seconda I.O. per frequenza(27% di tutte le I.O.in TI)- Prevalentemente batterica - S. aureus (MSSA) - S. pneumoniae, H. influenzae-------------------------Enterobatteri - Bacilli GN non fermentanti - S. aureus (MRSA)- Elevata mortalità

11. Early Onset Pneumonia EOP E.coli Klebsiella spp Proteus spp S.pneumoniae H.influenzae MSSA Late Onset Pneumonia LOP P.aeruginosa BGN con ESBL MRSA Acinetobacter spp ………. VAP: agenti eziologici in base al tempoCDC Draft 2002 NON Multi R Spesso Multi R

12. Immunodepressi per patologia di base - Fibrosi cistica: - P. aeruginosa (spesso mucoso) - Alcaligenes spp - B. cepacia - S. maltophilia - S. aureus - H. influenzae (anche non b) e S.pneumoniae - Aspergillus - Micobatteri spp

13. Il nemico Occorre conoscerne: • la patogenicità e i meccanismi di virulenza • le caratteristiche colturali (esigenze nutritive, l’atmosfera di crescita, i tempi di crescita) e la carica per distinguerlo fra la flora contaminante • i determinanti antigenici • le sequenze identificative • le sensibilità ad antibiotici e disinfettanti

14. L’importanza di un prelievo corretto oppure meglio:L’importanza di una interpretazione corretta in base al prelievo

15. Contributo della microbiologia Diversamente da altre indagini strumentali e di laboratorio, la richiesta di indagini microbiologiche presenta aspetti peculiari: il tipo e la qualità del campione condizionano in modo assoluto i risultati dell'indagine microbiologica, l'invio del campione al microbiologo sottintende la domanda: "C'è qualcosa nel campione che può contribuire alla diagnosi ed alla terapia della malattia infettiva?"; ciò equivarrebbe ad inviare al Laboratorio di chimica clinica un campione di sangue "per ricerca di anormalità chimiche", senza ulteriore indicazione o precisazione

16. Contributo della microbiologia Garbage in Garbage out

17. Il Manuale di raccolta M&V Ospedali Riuniti di Bergamo PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED INVIO DEI CAMPIONI PER INDAGINI MICROBIOLOGICHE 3a ed., maggio 2001, pag. 114 www.ospedaliriuniti.bergamo.it Altri Manuali consultabili al sito: www.apsi.it

18. Iter dell’indagine microbiologica

19. PolmonitiCampioni per la diagnosi eziologica • Materiali raccolti con metodiche protette, a bassa contaminazione • Lavaggio bronco-alveolare (BAL) • Lavaggio bronco-alveolare mirato con cateterino • Spazzolatura endobronchiale protetta (PSB) • Materiali ad alto rischio di contaminazione con saliva • Espettorato (o espettorato indotto o indotto-protetto) • Aspirato endotracheale / bronchiale / da tracheostomia • Altri materiali • Materiali bioptici • Liquido pleurico • Sangue (emocoltura, indagini sierologiche) • Succo gastrico (per micobatteri) • Tampone (aspirato) naso-faringeo (virus) • Urine (ricerca antigeni Legionella , Pneumococco)

20. Aspirato tracheo-bronchiale • Di semplice esecuzione, non richiede manovre invasive • La coltura identifica di solito il patogeno in causa (alta sensibilità), ma insieme ad altri microrganismi non responsabili dell’infezione (bassa specificità) • L’indagine microbiologica deve: • determinare la carica batterica (coltura quantitativa) • accompagnarsi all’esame microscopico (batteri e cellularità) Grossman R, Chest, 2000

21. Aspirato tracheo-bronchiale San Pedro, Chest, 2001

22. Lavaggio broncoalveolare • Procedura invasiva • Fattori che condizionano la “qualità” del BAL • competenza dell’esecutore • recupero > 10% della soluzione instillata • immediato invio alla microbiologia • terapia antibiotica in corso • Idoneità del campione • > 10 cellule per campo a x500 • presenza di < 1% di celluleepiteliali Grossman R, Chest, 2000

23. Tecniche diagnostiche Sensibilità Specificità Valore predittivo Positivo Valore predittivo Negativo Colture PSB (>103 CFU/mL) 82% 89% 90% 89% Colture BAL (>104 CFU/mL) 91% 78% 83% 87% Esaminazione microscopica di fluidi da BAL (>5% organismi intracellulari) 91% 89% 91% 89% Tecniche diagnostiche Sensibilità Specificità Colture PSB(>103 CFU/mL) 67% 95% Colture BAL(>104 CFU/mL) 73% 82% Esaminazione microscopica di fluidi da BAL 37-100% 89-100% Prelievi “protetti” e risultati microbiologici Mayhall G., Emerging Infectious Diseases, 2001 Grossman R., Chest, 2000 Grosman R, Chest, 2000

24. Infezioni delle basse vie respiratorie Possibilmente campioni protetti Solo se CAP grave: Espettorato o BroncoAsp Emocoltura (IDSA 2007) Solo campioni protetti: Broncolavaggio Spazzolatura Emocoltura (FADOI,’07)

25. Diagnosi delle infezioni respiratorie - Più del 50% non sono diagnosticate- Non c’è un solo test per fare diagnosi - coltura secrezioni - emocoltura - ricerca antigeni (RSV, Legionella, S.pneumoniae, Aspergillus,…)- Per i batteri, spesso non è unproblema tecnico, ma diinterpretazione !!!!

26. Diagnosi: due quesiti - Se isolo patogeni (spesso presenti anche nel cavo orale), sono quelli colonizzanti o sono quelli che hanno raggiunto il polmone? In pratica:Ho raccolto quelli del cavo orale o quelli dell’infezione ?

27. Diagnosi: due quesiti - Se isolo non patogeni (normalmente non presenti nel cavo orale), sono quelli che hanno colonizzato il tratto respiratorio alto o hanno raggiunto anche il polmone? In pratica:Ho raccolto quelli delle alte vie o quelli dell’infezione ?

28. Infezioni delle basse vie respiratorie La contaminazione con la flora del cavo orale inficia il risultato dell’esame colturale

29. Campioni NON protetti Passano attraverso il cavo orale:- Espettorato (anche indotto, protetto) Raccolti con broncoscopio attraverso il cavo orale:- Lavaggio tracheo-bronchiale Raccolti con aspirazione: - durante la broncoaspirazione di intubati:- Aspirato tracheo-bronchiale- attraverso fistola tracheostomica:- Aspirato da tracheo-stomia

30. Diagnosi Come evitare la raccolta dei colonizzanti?

31. Campioni protetti - PSB= Brushing endo-bronchiale protetto- Mini-BAL= Lavaggio bronco-alveolare protetto - BAL= Lavaggio bronco-alveolare (più negli immuno-compromessi o polmoniti interstiziali)

37. VAP: DiagnosiCDC Draft 2002 -GISIG 1998 • - i criteri tradizionali: • - clinici (tosse, febbre, leucocitosi, secrezioni purulente) • - strumentali (evidenze radiologiche di un infiltrato nuovo o progressivo) • - microbiologici (coltura dell’aspirato endotracheale, l.pleurico, sangue) • NON SONO SUFFICIENTI PER UNA VAP • PERCHE’ ASPECIFICI E INAFFIDABILI

38. VAP: Standardizzazione dei metodi diagnosticiCDC Draft 2002 -GISIG 1998 • - PSB (Protected Specimen Brush) • - BAL (Broncho-Alveolar Lavage) • - Mini-BAL (Protected Broncho-Alveolar Lavage)

39. Criteri di idoneità Esame microscopico Cellule bronchiali epiteliali squamose Neutrofili Batteri intracellulari Flora Cavo Orale Semina Non Protetti con 1 mcl Protetti con 10 mcl Rilevazione cariche Non Protetti > 106 ucf/ml Broncolavaggio > 104 ucf/ml Mini-BAL > 102 ucf/ml Identificazione microrganismi Patogeni Non Patogeni

40. Esame microscopico IdoneoNon idoneo

44. Esame microscopico: Q-score Lettura: media di 10 campi

45. Semina NON protetti Significative cariche >106 (10-100 UCF)

46. Semina protetti Significative cariche >103 (1-10 UCF)(104 per BAL: 10-100 colonie)

47. …e valutare il germe in causa Cioccolato 1l (diluito 1:10) - assenza crescita- 1 CFU = 104- 10 CFU = 105 - 100 CFU = 106 > 100 CFU = 107 Patogeni Non Patogeni FBM ATB +ID descrittivo FBM

48. Microrganismi respiratori Patogeni -BGN (fermentanti e non)-S. pneumoniae e beta-emolitici-S.aureus-Haemophilus influenzae-B.catarrhalis Non patogeni - S.coagulasi negativi- Strept. alfa-emolitici- Neisseriaceae- Altri Haemophilus

49. Emocoltura 20-30% polmoniti batteriche hanno batteriemia L’emocoltura dovrebbe essere sempre eseguita in caso di polmonite

50. Collaborare per vedere i problemi per quel che sono