KLT DENSITOMETER

1. KLT DENSITOMETER ny Guntarti FARMASI 2013

2. Kromatografi kertas

3. Kromatografi lapis tipis

4. KLT DENSITOMETER • Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT • Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm. • Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

5. Teknik penggunaannya : - Pengukuran sinar yang diserapdan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas), - Sinar yang diserap dan dipantulkan - Atau sinar yang dipendarkan. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer. 5

6. Pada era perkembangan teknik kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph Scanner" yang lebih populer dengan nama densitometer makin banyak dipakai . 6

7. lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan noda pada KLTsecara : • Absorpsi • Transmisi • Pantulan (refleksi) pendar fluor • Pemadaman pendar fluor 7

8. Sumber Radiasi • Padaumumnyaspektrofotodensitometermemberikanrentanggelombangpenentuan 200-630 nm. • Lampu D2 (Deuterium) dipakaiuntukpengukuranpadadaerah ultra violet danlamputungsteinpengukuranpadadaerahsinartampak. • Untukpenentuanpendarfluordanpemadamanpendar fluor dipakailampubusur Hg bertekanantinggi. • Padadensitometrijugadilakukanpenentuantransmisiatauabsorpsidanretleksipadapanjanggelombangmaksimal.

9. Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal. • Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi • Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

10. Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T. • S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT. 10

11. Lanjutan • Penentuankadaranalit yang dikorelasikandenganarea nodapada KLTakanlebihterjaminkesahihannyadibandingmetode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi)atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area nodakromatogramdiukurpadaposisilurusatau "Zig-zag" menyeluruh. • Korelasikadaranalitpadanodakromatogram yang dirajahterhadap area tidakmenunjukkangarislurus, akantetapimerupakangarislengkungmendekati parabola 11

12. Kurva hubungan serapan dan kadar • Persamaan Kubelka-Munk • Korelasikadaranalit yang dirajahterhadap area kromatogramtidakmerupakangarislurus. • Bila REM (RadiasiElektroMagnetik) denganintensitassemula (I0)jatuhpadapermukaanlapisantipis yang tidakhomogendenganarahrambatantegaklurus, makasebagiandari REM tersebutakan: • direfleksikan(Is) • diserapolehanalitlapisantipis (I) • diteruskan (It). • I=10+ Is+ It 12

13. Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai : • Is= I. E • Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat : • I0 =I-Is • I0=I-I.E=(I-E)I • Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri. • It =I0. e-KX 13

14. E = koefisienpermukaan lapis tipis ↓ Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt x = tebal medium lapis tipis k = koefisien absorbsi e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density” ↓ Parameter S (koef. Penghamburan) It =I0. e-KX

15. Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter : • K (koefisien absorbsi) • S (koefisien penghamburan).  • Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam. 15

16. - dl = + (S + K ) I + Sj dx dl = - (S + K ) I + Sj + dx Parameter S (koef. Penghamburan) • Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis • Sx = tiap pelat berbeda harganya = 0 -10

17. I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak lurus menuju permukaan lapis tipis j = radiasi elektromagnetik yang arahnya meninggalkan permukaan lapis tipis S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

18. ( I – R )2 C = E x 2R S Pernyataan Kubelkan – Munk : E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit pada pelat KLT C = kadar analit R = cahaya terpantul pada permukaan lempang ↓ Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan sebagai kurva parabola : A2 = f ( C ) log A = f ( log C )

19. Bagan Alat densitometer SumberSinar • Gambar Photo multiflier Untukrefleksi Sinarpolikromatis Sinarpantulan Sinar Mono kromator Monokromator Densitometer Single beam Densitometer Double beam Photomultiflier Untuksinar yang diteruskan 19

21. S S Mk Mk PM PS PM PM I I I I Lempeng Lempeng PM T ( a ) ( b ) Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

22. Photomultifliertersebutdapatmemperbesartenagabedapotensiallistriksehinggamampumenggerakanintegrator. • Integratordengansistemmikrokomputersecaralangsungdapat menghitungluaspuncakatautinggipuncaksecaraotomatik.Selain itumencatatnomerurut, kedudukanpuncakpada ordinal Y atauwakturetensinya. • Letak sumbu Y danX darilempengakan mempengaruhi hasil yang diperoleh. • Kalau Y disesuaikandenganarahgerakeluendansumbukX tegakluruspadanyaataumerupakanderetanpenotolansampelpadalempeng. Dengancaraitumerekaakanmendekatikepastian. 22

23. Cara kerja pelacakan bercak Densitometer 7 • Gambar 3 2 0,245 5b 145 5a 1 4 6 Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu, 1= pendukung Lempeng. 2=Sistemoptik (sinar). 3=Sumbersinar (UV/Visibel) 4= Tombolpenggeraklempeng, 5a= Angkakedudukanlempeng (mm) 5b= angkaserapan 6= Key Board, 7= kromatogram 23

24. Cara Kerja Densitometer Lempeng yang telahdigunakanuntukpemisahan. diujidulukedudukansetiapbercakpadasumbu(X,Y). agar sinardapattepatmengenaipusatbercak. • Setelahtomboldihidupkanlempengditempatkanpadasatugarisderetan Y,bercakdiatur, dangerakanlempengdiatursesuaikedudukanbercak, menggunakanmikrokomputer. • Panjanggelombangdiprogram agar terjadiserapansecaramaksimum, bilabelumdiketahuidilakukanscanning lebihdulu. 24

25. Scanningpengujiankuantitatifada 2 cara: • A. Cara memanjang • Sinardilewatkanpadatengahbercak, sehinggabercakhanyadideteksisepanjanggaristengahnyasepanjangsumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnyabaikbilabercakberbentukbulatsemetris. • B. Sistemzig-zag • Sisteminidiprogramberjalanmemanjangsumbu Y tetapiberbelok -beloksampaigaristepibercakpadagaris X, sehinggabergerakdari Y1-Y2, dan X1-X2. 25

26. y1 y2 b a • Pelacakanbercak, • Gambar. Cara pelacakanbercakdengan TLC Scanner • (a) Model zig-zag. ( b). model lurus Kelebihan penggunaanmetodezig-zaglebihmeratapengukurannya, apalagi delta Y menggunakanjarakterkecil. • Kelemahannyawaktu lebih lama, tetapiketelitianpengukuranlebihterjamindibandingpenggunaanmetodepengamatanlurus. x1 x2 26

27. Keterangan tambahan • Besarnyabercak, dari X1sampai X2 lebihbesardarigaristengahbercak agar semuabercakteruji. • Delta Y, selisihgariskesatudankeduamakinkecilmakin rata pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm,kode yang diberikanangka 1 sampaidengan 3. • Simbul Y tergantungdalammeletakkanlempengterhadaparahscanning, (lihatpanah) sesuaigaris Y, dangaristegaklurus Y adalahgaris X. 27

28. Perhitunganluasatautinggipuncaksudahdilakukansecaraotomatisolehalat, satuanluas area (mikro volt) yang terteramerupakanbesaranpuncak. Kadang-kadangprosentase yang tertulishanyamerupakankadarrelatifdaripuncak yang muncul (tergambar). • Dalampengamatanlurusbilabercaknyatidaksemitrisakankurangtelitisebabkonsentrasiterbesartidakselaludilewatisinarpelacakbercak. • Penotolandengan bercakkecilkemungkinanmolekulsenyawauntukmengumpulditengahlebihbanyak. 28

29. Analisis Kualitatif • Analisis kualitatifhanyadapatdibandingkanwakturetensinya, ataudilakukanpenyariandaribercaksetelahdielusi, dankemudiandiujisecaraspektroskopi. • Tetapiadanya densitometer, spektrogramnyadapatdiuji. Sinar mono kromatis Propilspektrogram IntensitasSerapan ` Bercak Panjanggelombang (nm) 29

30. Cara Menyari/ekstrasi Bercakpadalempeng yang dilihatdibawahsinar UV diberitanda (lingkari) denganujungpensil, kemudiandiambillapisantipisbersamabercaknya. Lapisan yang diambil dimasukkan kedalamgelaspiala, ditambahpelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dansetelahlarut,disaring. Kedalamlabutakar, dancairandijadikan volume sampaitepattanda ( 10,0 ml). Larutansiapdiujidenganalatspektrofotometer.

31. Larutan yang didapatdiujidenganspektrofotometer padapanjanggelombangserapanmaksimumnya. • Karenapengenceranmerupakanfaktorpentinguntukperhitungankadarsenyawa yang diujisecarakuantitatifsegalacaranya, Diencerkan Disaring Dilarutkan

32. Gambar Chamber yang banyak digunakan KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) Chamber lempeng Tutup dapat diganti, dengan tutup yang dapat dihubungkan pompa hampa, dapat digunakan untuk menyimpan lempeng yang telah dikeringkan

33. *Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring. *Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap. *Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh

34. Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri) Lempeng

35. ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY 1 2 3 4 1. Pelacak bercak 2. Monitor 3. PC 4. Key Board

36. Pipakapiler Totolan Totolan manual. Penotolan

37. Chamber Tempatelusi Lempeng Silica gel Bercak Cairanelusi

38. JALANNYA SINAR (OTIK)

40. Aplikator, penotol sampel otomatik

41. HASIL SCANNING SATU BERCAK

42. Scanning senyawa yang berbeda Senyawa a1, a2, berbeda, sehingga mempunyai serapan maksimum pada lambda yang berbeda. b 1 b b 2 Digunakan metode: • Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya. • Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang dapat dimiliki oleh semua senyawa. a a a Demikian pula senyawa b1, b2, berbeda, sehingga mempunyai serapan maksimum pada lambda yang berbeda. 2 1

43. HasilRekaman Cara satu persatu • Hasil a a 2 1 b b 2 1 Kurva Kurva a a 1 2 Cara serentak Kurva a a + 2 1 Kurva Kurva b b 1 2 Kurva b + b 1 2

44. HASIL ELUSI HASIL SCANNING SERENTAK BERCAK BAKU BERCAK SAMPEL SEBELUM ELUSI

45. Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

46. Scanning serentak beberap puncak/bercak

48. MENGHITUNG WAKTU RETENSI z Batas eluen d y x Rf = a/c (cm) b/c (cm) e a f b C Yang ditampilkan oleh rekaman Arah scanning Bila rekaman kekanan Rf =x/z atau y/z Karena alat tak tau berapa jarak migrasi eluen Bila rekaman kebawah Rf =d/f atau e/f Karena alat tak tau berapa jarak migrasi eluen, dan tempat penotolan

49. Contoh 1 • Analisisgolongantetrasiklin, denganfasediam :seluluse F, Fase gerak: larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993). Kromatogramtetrasiklindanturunannyadilihatdibawahsinar UV, 366 nm • IsotetrasiklinRf =0,02 (coklat), • AnhidroterasiklinRf=0,3(merah-ungu) • Terasiklin HClRf =0,73 (merahungu) . . . . . . . . . . . 0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0 49

50. TETRASIKLIN Tetrasiklin C22H24N2O8 sda Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl 7-Cl Oksitetrasiklin C22H24N2O9 5-OH