Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Nina Salamah, MSc., Apt

2. Pendahuluan • Penggunaan bahan alam khususnya tanaman dalam pengobatan sudah berlangsung lama • Trend “back to nature” : produk herbal meningkat • Metode Farmakope: Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

3. Kromatografi suatu teknik pemisahan campuran menjadi komponennya berdasarkan perbedaan migrasi masing-masing komponennya dalam fase diam akibat pengaruh dari fase gerak • Analyze • Identify • Purify • Quantify Separate Mixture Components

5. Illustration of Chromatography Stationary Phase Separation Mobile Phase Mixture Components

6. Kromatografi Lapis Tipis • Kromatografi padat-cair • Kromatografi planar • Fase diam berupa lapisan tipis pada permukaan datar di atas pendukung yang sesuai • Keunggulan dibanding KCKT: mudah, sederhana, murah, cepat • Kekurangan dibanding KCKT: daya pemisahan dan sensitivitas lebih rendah, terpengaruh lingkungan

7. Komponen penting pada analisis dengan KLT • Peralatan (chamber) • Fase Diam • Fase gerak • Aplikasi sampel • Pengembangan • Deteksi bercak

9. Fase Diam • Fase diam pada KLT berupa fase yang polar (fase normal) maupun fese non polar (fase terbalik). Fase normal • 1. Silica gel • Merupakan silica yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit asam, fase ini lebih banyak digunakan. Untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung, silika gel ditambah gips (Kalsium sulfat) sehingga dikenal dengan silica gel G. • Sebagai pendukung lapisan tipis digunakan kaca, dengan ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20, atau 5 x 10 cm. Pendukung yang lain berupa lembaran aluminium, atau plastik dengan ukuran scperti diatas, yang umumnya dibuat oleh pabrik.

10. Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa flouresens, agar bila disinari dengan sinar UV berflourosensi atau berpendar, sebingga dikenal dengan silica gel GF254, yang berarti silica gel dengan flouresen yang berpendar pada 254 nm 2.Alumina, (aluminium oksida) Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih jarang digunakan, bila akan digunakan diaktifkan kembali dengan pemanasan. Alumina yang digunakan sebagai fase diam untuk KLT umumnya yang bebas air, schingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih tinggi.

11. 3. Kiselguhr Sebenarnya merupakan asam silica yang amorf, berasal dari kerangka diatomeae, maka lebih dikenal dengan nama tanah diatome, kurang bersifat adsorptif dibanding silica. 4. Magnesium silicat Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan floresil, hanya digunakan bila adsor ben atau penjerab lain tidak dapat digunakan. 5 Selulose Polaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai pemisah sccara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk Icmpeng. Keduanya masih sering dipakai misalnya untuk pemi sahan flavanoid.

12. Fase diam • Umumnya digunakan silika • Dapat ditambahkan pengikat dan indikator fluoresensi • Mekanisme dominan: adsorbsi kadang partisi • Fase gerak/eluen/pelarut • Berdasarkan polaritas • Biasanya campuran • Studi pustaka dan coba-coba • Prinsip: like dissolves like • Senyawa polar lebih tertahan oleh fase diam • Senyawapolar lebih mudah larut dalm fase gerak yang polar

13. Simbol-simbol Pelat KLT • Si atau Sil Mengandung silika • 60 Ukuran pori • F atau UV Mengandung indikator fluoresensi • 254 atau 366 Setelah simbol F atau UV untuk menunjukkan panjang gelombang eksitasi indikator fluoresensi • G Pengikat gipsum (kalsium sulfat) • H atau N Tanpa pengikat • RP Reversed Phase, silika yang dimodifikasi dengan hidrokarbon • 2, 8, 18 Panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika • P Untuk preparativ

14. Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas pelarut

15. Aplikasi sampel • Totolan bercak sekecil mungkin • Biasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak menyebar dan bertumpuk • Digunakan pelarut sampel yang bisa melarutkan sampel dengan baik, tetapi mudah menguap dan daya elusinya kecil • Secara manual/otomatis • Dapat digunakan pipa kapiler, mikropipet, mikrosiring

16. Rf=jarak yang ditempuh oleh komponenjarak yang ditempuh oleh pelarut

17. Deteksi Bercak • Berwarna atau tidak • Dengan lampu UV 254/366 nm • Jika menggunakan pelat KLT F: bercak yang tidak berfluoresensi terlihat sebagai pemadaman (gelap) pada latar belakang hijau/biru • Dengan penampak bercak • Disemprot/dicelup/diuapi • Destruktif/tidak • Umum/selektif

19. Visualization (Detection of spots): A- Universal methods: 1- Destructive methods: The plated are sprayed with corrosive reagents and then heated in oven where organic compounds will give charred spots. After this treatment the materials can not be recovered. e.g. Anisaldehyde / H2SO4 Vanillin / H2SO4

20. 2-Non – Destructive methods: In these methods the materials can be recovered. • Day light for colour compounds. • UV light for fluorescent compounds (conjugated double bonds). • I2 vapour for any compounds contain at least one double bond • Spray with water where organic compounds appear as white opaque spots.

21. B- Specific Methods: • These reagents are used for the detection of certain classes of compounds. They are usually destructive. • Dragendorff΄s reagent for Alkaloids. • Ferric Chloride (FeCl3) for phenolic compounds. • Aniline phthalate for sugars. • Ninhydrine for nitrogenous compounds as Amines, Amino acids.

22. 22 Tabel Beberapa penggunaan pelacak bercak pada kromatografi kertas Sebyawa fiuoresen Amin ter/kuater. Turunan karbamat HeterosikUk amin kanabinol, sulfonamida Alkaloid/Amin kuar Ter.Heksa(penta klorfenol) Ikatan rangkap, seny.organik 22

23. Rate of flow (RfValue): Distance traveled by the spots Rf= ----------------------------------------- Distance traveled by the solvent The Rf of any compound must be less than one.

24. Tailing in Paper Chromatography: In some cases instead of getting round spots a Tailed or comet like spots are obtained leading to overlapping of the spots and poor resolution.

25. Reasons and solution for tailing problem: 1-Ionic characters of acids and bases when they are chromatographed under neutral conditions. Solution: add acids or bases to the developing system. 2-Application of large amounts of material. Solution:decrease conc. of material. 3-Unproper choice of solvent system. Solution:change the solvent system.

26. Application: 1- Qualitative: • Identification through comparison of the Rfvalue with that of Reference material. • Determination of Complexity of mixtures. That will be indicated from number of spots. • Determination the purity of materials. • Monitoring the progress of Chemical reactions. • Monitoring of column chromatography. • Development of finger print TLC for extracts, volatile oils or pharmaceutical preparation for future identification and comparison. In this application plates 5×5, 5×10 cm with thin film of coating material are usually used.

27. 2- Quantitative: In this case an accurate volume of samples are applied using syringes. The dimensions of plates range from 5x10 to 20x20 according to the number pf spots used. The plates are developed as usual in the chromatographic tanks. After development the concentration of material can be determined by: • Spot area measurement: Which is directly proportional to the conc. of materials. • Photodensitometry: Measure transmittance, reflection or fluorescence of spots. • Radioactivity: For radioactive material. These measurements are done using TLC Scanner connected to computer that perform all calculations.

28. 28

29. 29

30. Maturnuwun