1 / 18

Komplementārās DNS sintēze

Komplementārās DNS sintēze. Agnese Ezerta (ae10021) . Kas ir komplementārā DNS?. Komplementārā DNS jeb kDNS - DNS, kas nes hromosomālajā DNS atrodamā gēna kodējošo secību. Atšķirībā no hromosomālās DNS :

amelia
Download Presentation

Komplementārās DNS sintēze

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Komplementārās DNS sintēze Agnese Ezerta (ae10021)

  2. Kas ir komplementārā DNS? Komplementārā DNS jeb kDNS- DNS, kas nes hromosomālajā DNS atrodamā gēna kodējošo secību. Atšķirībā no hromosomālāsDNS: •nesatur nekodējošos rajonus (intronus); •iegūta ar sintēzes palīdzību, izmantojot mRNS virkni. otrās ķēdes kDNS sintēze pirmās ķēdes

  3. Nedaudz vēstures... ◈ Reversā transkriptāze (RNS atkarīgā DNS polimerāze) – H. M. Temins un D. Baltimors 1970. gads. Hovards M. Temins Deivids Baltimors

  4. Komplementārās DNS pielietojums • gēnu ekspresijas detektēšanai; • eikariotisko gēnu klonēšanai prokariotos; • kDNSbibliotēku veidošanai; • kalpo kā pamats otrās ķēdes kDNS sintēzei.

  5. kDNS sintēzes pamatprincips Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.

  6. Sintēzei izmantojamie reaģenti un to funkcija • Reversā transkriptāze– veic kDNS sintēzi, gar RNS matricu pārvietojas 3’→5’ virzienā, sintezējot kDNS 5’→3’ virzienā. • RNS praimeris– veido bāžu pārus ar RNS matricu, ierosina kDNS fragmenta sintēzi. • Dezoksiribonukleotīdutrifosfāti (dNTP) – bāzes kDNS virknes veidošanai. • Ribonukleāžu inhibitors – kDNS sintēzes laikā aizsargā RNS no degradēšanās. •Reakcijas buferis ar MgCl2– sintēzes laikā nodrošina optimālo pH, enzīma specifiskumu substrātā un tā maksimālo aktivitāti. • T4 DNS polimerāze I – katalizē DNS sintēzi 5’→3’ virzienā. • RNāze H– degradē mRNS ķēdi. • Reakcijas buferis DNS polimerāzei I – nodrošina DNS polimerāzes I darbību.

  7. Pirmās ķēdes kDNS sintēzē izmantojamo praimeru specifiskums Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.

  8. Reaģentu izplatītāji

  9. Otrās ķēdes kDNS sintēzes veidi 1. Matadatas-Praimera sintēze; http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/18267.pdf

  10. Otrās ķēdes kDNS sintēzes veidi 2. Okayama un Berga procedūra; 3. Gublera un Hoffmana procedūra. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/18267.pdf

  11. Izmantojamās ierīces • Vortex (Centrifūga); • Termostats; ⇢ Ierīce parauga sajaukšanai un nostādināšanai. ⇢ Ierīce nepieciešamas pastāvīgas temperatūras nodrošināšanai.

  12. Darba drošība → jāvelk halāts un gumijas cimdi; → darba virsma un mehāniskās pipetes jānotīra ar 75% etanolu; → pipešu uzgaļiem jābūt steriliem; → darbu var veikt boksā.

  13. Darba gaita – piemērs pirmās ķēdes kDNS sintēzei • Uz ledus sajauc • 500 ng RNS; • 1 µl 100 µMOligo(dT)18praimeri; • Ar DEPC apstrādātu ūdeni līdz 12,5 µl. 2. Sajauc un inkubē 5 min +65ºC. 3. Uz ledus atdzesē un paraugam pievieno 4 µl 5X reakcijas buferi ar MgCl2; 2 µl 10 mMdNTP maisījumu; 0,5 µl 40 u/µlribonukleāžu inhibitoru; 1 µl200 u/µl reverso transkriptāzi. 4. Sajauc un inkubē 1 h +42ºC, pēc tam 10 min +70ºC. 5. Paraugu uzglabā pie -20ºC.

  14. Piemērs ar rezultātiem– RT-PCR PCR produkti tika noteikti 3% agarozesgēla elektroforēzē. Gēna CD90 ekspresijas detektēšana ADSC Gēna β-aktīns ekspresijas detektēšana ADSC

  15. kDNS metodes +/- + vienkārši un ātri veicama; + iespējams iegādāties visus nepieciešamos reaģentos kopā (kits); + lēta; + nav nepieciešama dārga aparatūra. - jāstrādā ļoti uzmanīgi.

  16. Izmantotā literatūra • Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. 2002. Biochemistry. 5th edition. New York: W.H. Freeman and Company, 974 pp. • Collen S., Marks A.D., Lieberman M. 2007. Marks basic medical biochemistry. A clinical approach. 2nd edition. Baltimore: Lippincott Williams and Wilkins, 565 p. • Farrell R.E. 2010. RNA methodologies. A laboratory guide for isolation and characterization. 4th edition. London: Elsevier, 717 pp. • Herdewijn P. 2005. Methods in molecular biology. Vol.288. Oligonucleotide synthesis. Methods and Applications. Totowa: Human Press, 435 pp. • Metzler D.E. 2003. Biochemistry. The chemical reactions of living cell. 2nd edition. Vol.1 and 2. Portland: Elsevier, 1900 pp. • Mulhardt C. 2007. The experimental series. Molecular biology and genomic. California: Elsevier, 257 pp. • Wilson K, Walker K. 2010. PrinciplesandTechniquesofBiochemistryandMolecularBiology. 7th edition. Cambridge: CambridgeUniversityPress, 749 pp.

  17. Paldies par uzmanību!

  18. Kontroljautājums Nosauciet trīs praimeru veidus, kuri izmantojami, lai sintezētu pirmās ķēdes kDNS no mRNS?

More Related