Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 11. lekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. GIvektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Vektora izvēle un sagatavošana Insertējamās DNS ieguve un sagatavošana Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. DNS klonēšanas vektori Lai DNS secību pavairotu in vivo nepieciešams nesējs - vektors. Vektors ir DNS molekula, vai komplicētāks veidojums, kurš spēj iekļūt un replicētiesnoteiktās šūnās. Vektors - manipulācijām izvēlētās DNS nesējs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. DNS klonēšanas vektori Vektorā ar rekombinantās tehnoloģijas palīdzību var iekonstruēt citu(-s) DNS fragmentu(-s). Pēdējā laikā ar vektoru mēdz apzīmēt arī vektora DNS apņemošas vīrusu daļiņas, liposomas u.c. veidojumus, kuri nepieciešami rekombinantās DNS transportam augstāk attīstīto organismu gēnu inženierijas eksperimentos, atvieglo tā integrāciju genomā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. DNS klonēšanas vektori DNS klonēšanas vektoriem jāatbilsts sekojošām prasībām: • pastāv efektīva metode vektora ievadīšanai saimniekšūnā, • vektora DNS spēj replicēties saimniekšūnā un tādējādi tas saglabājas šūnām daloties un ir iespējams iegūt daudzas vektora kopijas, • pastāv efektīva metode vektora un saimniekšūnas DNS atdalīšanai, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. DNS klonēšanas vektori Klonēšanas vektoriem jāatbilsts sekojošām prasībām: • vektors satur unikālus restrikcijas endonukleāžu saitus. (šķeļ tikai vektora vienā vietā) • vektors satur selektīvu marķieri (-us), kas norāda uz vektora klātbūtni saimniekšūnā, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. DNS klonēšanas vektori Klonēšanas vektoriem vēlams: • unikāli restriktāžu saiti marķiergēnā, tādējādi ļaujot atlasīt rekombinantus, kas satur insertus (negatīvā atlase), • vēl labāk, ja vektors satur kādu ātri un ērti novērojamu fenotipisku marķieri, kuru var inaktivēt vai aktivēt ar ievietoto insertu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. DNS klonēšanas vektori Klonēšanas vektoru klasifikācija: • pēc vektora pielietojuma: - klonēšanas, - subklonēšanas, - ekspresijas vektori. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. DNS klonēšanas vektori Klonēšanas vektoru klasifikācija: • pēc vektora izcelsmes un pastāvēšanas veida: - plazmīdu, - bakteriofāgu, - citu vīrusu vektori, - mākslīgās hromosomas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Plazmīdu vektori Plazmīdu vektori ir izveidoti uz dabisko baktēriju plazmīdu bāzes, tās pārveidojot un pielāgojot noteiktām gēnu inženierijas eksperimentu vajadzībām. Dabiskās plazmīdas - ekstrahromosomālas, nelielas cirkulāras dpDNS molekulas (episomas), kuras parasti saimniekam dod izdevīgas fenotipiskas pazīmes, piemēram, rezistenci pret kaut ko kaitīgu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Dabīgās plazmīdas Nosacījumi dabīgo plazmīdu eksistencei: - spēja replicēties, - saimniekorganisms gūst priekšrocības vai - ir citi mehanismi, kas piespiež saimniekšūnai saglabāt plazmīdu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Dabīgās plazmīdas DdabīgāsE. coli plazmīdu grupas: - F plazmīdas (fertiliātes faktors), - R plazmīdas (antibiotiku rezisence), - Col (kolicīnu) plazmīdas, - D plazmīdas (biodegradācijas plazmīdas) - nes gēnu komplektu kāda neraksturīga savienojuma izmantošanai katabolismā, - Kriptiskās plazmīdas - fenotipiski to klātbūtne neizpaužas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Dabīgās plazmīdas R plazmīdas medicīniski nozīmīgas, Penicilīns - ieviests 40-to gadu sākumā. Penicilīnu noārda penicilināze. Staphylococcus aureusrezistences attīstība: 1946 - 14% PenR 1947 - 38% PenR 1969 - 59% PenR 70-tajos - ap 100% PenR Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Dabīgās plazmīdas Col plazmīdas - producē kolicīnus. Kolicīni - antibakteriāli proteīni, pamatā skar Col negatīvas E. coli, un tām radniecīgu baktēriju (Shigella,Salmonella) līnijas. Col plazmīdas saimniekšūnām dod priekšrocībasizdzīvošanas konkurencē. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Dabīgās plazmīdas Kolicīniu darbības virzieni: - veido poras šūnas membrānā, traucējot radīt un uzturēt membrānas potenciālu - 5, 10, A, B, Ia, Ib, K, N, E1; - endo-DN-āzes, to aktivitāte, bojā genomisko DNS - E7, E8, E9; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Dabīgās plazmīdas Kolicīniu darbības virzieni: - RN-āzes aktivitāte - bojā 16S rRNS, traucē proteīnu sintēzi - E3, E4, E6; - inhibē DNS sintēzi - E2. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Plazmīdu izplatīšanās Tikai neliela plazmīdu daļa spēj efektīvi izplatīties. (aktīvi, izmantojot speciālu pielāgojumusistēmas) Tās sauc par konjugatīvām plazmīdām - izplatās konjugācijas ceļā (F plazmīdas). Tam nepieciešams liels gēnu komplekts (tra-operons). Šo gēnu produkti nodrošina: - laba starpšūnu kontakta izveidi (F pils), - specifisku plazmīdu replikāciju (oriT), - DNS molekulas pārnesi(mob). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Plazmīdu izplatīšanās Transformācija - salīdzinoši neefektīvs DNS izplatīšanās veids. Efektīvai plazmīdu pārnesei nepieciešamās stadijas: 1. Efektīgs kontakts starp šūnām, 2. Mobilizācija - DNS sagatavošana pārnesei, 3. DNS pārnese, 4. DNS pārgrupēšanās recipienta šūnā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. Plazmīdu izplatīšanās Pēc spējām izplatīties plazmīdas var iedalīt 4 grupās: 1. Sevi nepārnesošas - nespēj ne veidot kontaktus starp šūnām ne veikt DNS pārnesi, ne tikt pārnestas ar citu palazmīdu palīdzību; 2. Pašpārnesošās (konjugatīvās) - ir gan konjugācijas gan mobilizācijas mehanismi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. Plazmīdu izplatīšanās Pēc spējām izplatīties plazmīdas var iedalīt 4 grupās: 3. Mobilizējamās - spēj izmantot konjugatīvo plazmīdu kodēto DNS pārnešanas sistēmu (piemēram, ColE1; RSF1010). Šīm plazmīdām ir oriT un mob gēns. Palīdzošajai konjugatīvajai plazmīdai: - jātrodas tajā pašā šūnā; - tā uz recipientšūnu var arī nepārceļot. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Plazmīdu izplatīšanās Pēc spējām izplatīties plazmīdas var iedalīt 4 grupās: 4. Kointegratīvās plazmīdas - spēj: - rekombinācijas ceļā apvienoties ar kādu konjugatīvo plazmīdu, - kopā pārceļot uz citu šūnu, - pēc tam atkal atdalīties. Procesu sauc par kondukciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Plazmīdu izplatīšanās Kointegratīvās un mobilizējamās plazmīdas nevar izplatīties ar nesaderīgu palzmīdu palīdzību. Visas E. coli plazmīdas iedala aptuveni 35 saderības grupās. Ar kointegrācijas un mobilizācijas palīdzību var izplatīties tikai tās plazmīdas, kuru saderības grupā atrodas kāda konjugatīvā plazmīda. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. Plazmīdu vektori Obligāti plazmīdu vektoru komponenti: ! replikācijas iniciators (ORI; oridžins) ! selektīvais marķieris ! restriktāžu saiti klonēšanai + sistēma fenotipiskai rekombinantu atlasei + transkripcijas un translācijas signāli (ekspresijai) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Plazmīdu vektori Pirmā plazmīdu vektoru paaudze - eksperimenti ar dabā sastopamajām plazmīdām. Tiek izmantota R grupas tetraciklīna rezistences gēnu nesoša plazmīda no Salmonella typhymurium (E. coli). 1973. gads - dabā atrasta plazmīda - pirmais klonēšanas vektors. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. Plazmīdu vektori Herbert Boyer, University of California at San Francisco Stanley Cohen, Stanford University Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. Plazmīdu vektori pSC101. (Stanley Cohen101. atrastā plazmīda ?) Apmierina visas klonēšanas vektora minimālās prasības : 1.) spēja autonomi replicēties; 2.) selektīvais marķieris; 3.) unikāli restriktāžu saiti Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Plazmīdu vektori pSC101 vektors tika sašķelts arEcoRI restriktāzi, tam tika pievienoti EcoRI šķelšanā iegūtiXenopus laevisgenomiskās DNS fragmenti, DNS molekulas tika apvienotas ar DNS ligāzes palīdzību, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. Plazmīdu vektori Ar rekombinantajām plazmīdām tika transformētas TcSE. coli šūnas, Barotnei pievienotā tetraciklīna dēļ izauga tikai plazmīdas saturošo baktēriju kolonijas - tās bija kļuvušas TcR . Analizējot rekombinantās palzmīdas, tajās tika atrasts Xenopus laevisrRNS gēna fragments. 1973. gads Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Plazmīdu vektori Cohen, S. N., A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, and R. B. Helling. 1973. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 3240-3244. 1973. gads Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. Plazmīdu vektori Pirmais gēnu inženierijas eksperiments tika veikts 1972. gadā. Paul Berg(1926 - ) apvienoja SV40 un l bakteriofāga geno- mus, izmantojot: - endonukleāzes, - terminālo transferāzi un - DNS ligāzi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Plazmīdu vektori Drošības apsvērumu dēļ, izveidotie vīrusu himēri baktērijās netika ievadīti. 1980. ķīmijā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Plazmīdu vektori pSC101 trūkumi: • zems kopiju skaits (1- 5, stingra kopiju skaita kontrole), tādēļ samērā grūti pavairojama; • maz unikālu restriktāžu saitu un tie nav ērti izvietoti; • rekombinantu atlasi var veikt tikai izmantojot restrikcijas analīzi, jo ir tikai 1 selektīvais marķieris; • pārāk liels izmērs, kas jūtami samazina transformācijas efektivitāti Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Plazmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML