Zdroje dat v toxikologii

1. Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii Zdroje dat v toxikologii

2. Základní zdroje dat • pozorování lidí vystavených účinku toxické látky • v pracovním prostředí • v životním prostředí • v důsledků havárií apod. Epidemiologické studie • záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků Klinické studie • pokusy na laboratorních zvířatech (in-vivo) • pokusy na tkáňových kulturách a mikroorganismech (in-vitro) • Amesův test - test genotoxicity na histidin auxotrofním kmenu bakterie Salmonela Typhimurium

3. Epidemiologické studie Rozdělení z hlediska způsobu realizace studie • observační (pozorovací) studie (observational study) • sběr dat bez přímého vlivu na probíhající děj • deskriptivní studie - popis rozložení onemocnění v populaci • analytické studie - objasnění příčin vzniku onemocnění • intervenční (experimentální) studie (intervention trial) • kontrolovaná a řízená expozice sledované látce • optimalizované podmínky experimentu Rozdělení z časového hlediska • prospektivní - sledování začíná s počátkem expozice • retrospektivní - sledování začíná v průběhu či po ukončení expozice

4. Epidemiologické studie Observační (pozorovací) KVALITA VÝPOVĚDI Kauzistiky (case reports) Série případů (case series) Ekologické studie (ecological studies) DESKRIPTINÍ Surveillance Průřezové studie (cross-sectional studies) ANALYTICKÉ Studie případů a kontrol (case-control studies) Kohortové studie (cohort studies) Intervenční (experimentální) Klinické studie (clinical trial) Terénní kontrolované studie (field trial)

5. Základní pojmy a veličiny Prevalence Incidence

6. Základní pojmy a veličiny Riziko a relativní riziko Tabulka 4.1: Čtyřpolní tabulka s daty z průřezové studie nebo z kohortové studie s počty osob Riziko onemocnění u exponovaných osob R1 = a / (a + b) Riziko onemocnění u neexponovaných osob R2 = c / (c + d) Relativní riziko RR = a / (a + b) c / (c + d)

7. Základní pojmy a veličiny Šance a poměr šancí Tabulka 4.1: Čtyřpolní tabulka s daty z průřezové studie nebo z kohortové studie s počty osob Šance onemocnění u exponovaných osob O1 = a / b Šance onemocnění u neexponovaných osob O2 = c / d Poměr šancí OR = a d c b

8. Epidemiologické studie - typy Kauzistika • detailní popis průběhu onemocnění (otravy) jednotlivce Série případů • detailní popis série onemocnění • jedinci ve studii určitým způsobem propojeni Surveillance • propojení řady sérií případů a kauzistik • sledování trendů ve vývoji onemocnění • analýza dat, interpretace, využití závěrů při preventivním opatření • cílem detekce a popis problému a hlavně formulace hypotéz o příčinách problému a způsobech řešení (akutní situace - epidemie)

9. Acute nicotine poisoning: Case ReportOberst B.B. and McIntyre M.A.,Pediatrics 11, 338-340, (1953) Stručný popis případu Chlapec, běloch 2 a ¾ roku si stěžoval na svědění v oblasti konečníku. Po odchodu rodičů do zaměstnání se jeho babička rozhodla na radu kamarádky provést odčervovací zákrok, a to i přesto, že v chlapcově stolici nebyla přítomnost červů patrná. V horké vodě vyluhovala polovinu balíčku tabáku značky „Bull Durham“ a po vychladnutí aplikovala chlapci roztok jako klystýr. Za 15 min po aplikaci se chlapci objevila pěna kolem úst, začal zvracet a upadl do záchvatu epileptických křečí. Po přijetí do nemocnice měl chlapec silné dýchací obtíže, ochablé svalstvo, byl bledý a nekomunikoval. Měl upřený pohled vzhůru, rozšířené zornice samovolně reagující na světlo. Sliznice v ústech byla bledá. Paralýza mezižeberního svalstva byla doprovázená bráničním dýcháním. Puls byl nitkovitý a nepravidelný - 66 pulsů za minutu, krevní tlak nebyl detekován. Pacient byl napojen na tlakový kyslík, 2,5 % glukóza i.v., ½ Ringerův roztok i.v., Calcium gluconate 1 gm v 10% glukóze i.v., Caffeine sodium benzoate 0,22 gm byl podán okamžitě, pak po dvou a po čtyřech hodinách a pak každé čtyři hodiny. Během pěti hodin puls stoupl na 84-96 pulsů za minutu, tlak stoupl z 80/0 na 108/60 mm Hg během 3 h. Stav pacienta se neustále zlepšoval. Následující ráno byl schopen komunikace, jídlo snášel dobře, nitrožilní výživa přerušena po 12h, pacient byl odpojen od přívodu kyslíku, svalová paralýza odezněla po 18h, po týdnu stav pacienta normální jak po fyzické tak po psychické stránce

10. Epidemiologické studie - typy Ekologická (korelační) studie • vztah mezi nemocí a rizikovým faktorem na úrovni populace • klíčová data nejsou na individuální, ale pouze na skupinové úrovni (denní průměrná koncentrace SO2 v Pardubicích) • jednotkou analýzy je skupina • závěry obvykle nelze jednoduše vztáhnout k jednotlivcům • vhodné k vytváření hypotéz, nikoli k jejich testování • levné, rychlé a celkem snadné provedení

11. Durkheim E.: Suicide: Study in Sociology. Free Press, New York, 153-154 (1951) Tabulka: Relativní počet sebevražd na 100000 obyvatel a podíl protestantů v populaci Jestliže jsou všechny osoby ve výběru protestanti (x = 100%), odhad rizika sebevražd se rovná y = 3,66 + 0,24 *100, jestliže ve výběru není žádný protestant (x = 0%), y = 0,36 + 0,24*0, relativní riziko sebevraždy v čistě protestantském a čistě katolickém kraji pak vypočteme Ekologická studie V klasické ekologické studii byl sledován výskyt sebevražd v pruských regionech během druhé poloviny 19. století. V tabulce 6.1 a na obrázku 6.5 jsou zobrazena data reprezentující 4 pruské regiony v letech 1883 a 1890 a popisující relativní počty sebevražd a podíl protestantů v těchto oblastech. a proto lze říct, že mezi protestanty je 7,6 krát větší počet sebevražd než u katolíků. Nebo nelze? A známe my vyznání u konkrétních případů sebevražd? Neznáme. Co když se sebevraždili zejména katolíci žijící v oblastech s vysokým počtem protestantského obyvatelstva?

12. Epidemiologické studie - typy Průřezová studie • retrospektivní studie • náhodný výběr jedinců ze studované populace • jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice • okamžitá prevalence expozic a okamžitá prevalence onemocnění • rozdělení výběru na čtyři skupiny – Exponovaní s nemocí; Exponovaní bez nemoci; Neexponovaní s nemocí a Neexponovaní bez nemoci • vhodné pro sledování chronických účinků • může být jak deskriptivní tak analytická

13. Průřezové studie (cross-sectional studies)

14. Blood lead levels and mortality: Cross-sectional StudyLustberg M., Silbergeld E.,Archives of Internal Medicine 162, 2443-2449, (2002) • studie zjišťující vztah mezi úmrtností a koncentrací Pb v krvi (USA) • sledovaná populace - 1976 – 1992, počet jedinců 9 250, zemřelo 2 145, hrubá úmrtnost 23,2 % • srovnávací populace – počet jedinců 4 190, zemřelo 929, hrubá úmrtnost 22,2 %

15. Epidemiologické studie - typy Studie případů a kontrol • retrospektivní analytická studie • testování hypotéz o příčinách onemocnění, o vztahu mezi expozicí a onemocněním • nejprve identifikace „případů“ – jedinci se sledovaným onemocněním • dále výběr skupiny „kontrol“ – jedinci bez sledovaného onemocnění, ale v ostatních aspektech (věk, pohlaví, sociální status, atd.) co nejvíce podobní případům • v obou skupinách hodnotíme úroveň expozice • úroveň ve skupině „případů“ vyšší než ve skupině „kontrol“ – rizikový faktor • úroveň ve skupině „případů“ nižší než ve skupině „kontrol“ – protektivní faktor

16. Studie případů a kontrol (case-control studies)

17. Cannabis intoxication and fatal road crashes in France: Population based Case-Control StudyLaumon B., Gadegbeku B., Martin J.L., Biecheler M.B.,British Medical Journal 331, 1371-1374, (2005) • poměr šancí způsobit smrtelnou dopravní nehodu u jedinců pod vlivem Δ9 tetrahydrokanabinolu ve srovnání s neintoxikovanými jedinci • případy – 6 766 viníků smrtelné dopravní nehody • kontroly – 3 006 účastníků smrtelné dopravní nehody, kteří tuto nehodu nezavinili

18. Epidemiologické studie - typy Kohortové studie • prospektivní analytická studie • testování hypotéz o vztahu expozice a onemocnění • skupiny jedinců (kohorty) složeny z jedinců nevykazujících na počátku studie sledovaný zdravotní efekt na základě určitého společného znaku • jednotlivé kohorty se liší úrovní expozice – např. exponovaná a neexponovaná • kohorty určitý čas (několik let) sledovány – v kohortách zaznamenávány jednotlivé případy onemocnění

19. Kohortové studie (cohort studies)

20. Alcohol drinking and renal cell cancer risk in cohort of finish male smokers Prospective cohort StudyMahabir S., Leitzmann M.F., Virtanen M.J. at allCancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 14 (1), 170-175, (2005) • po dobu 12 let sledováno 27 111 mužů z Finska, kuřáků, ve věku 50 – 69 let • v rámci studie byla sledována míra konzumace alkoholu (množství, preferovaný typ nápoje) • 195 případů RCC (renal cell cancer) • prokázán protektivní vliv konzumace alkoholu na vznik RCC u starších mužů kuřáků

21. Zkreslení Výběrové zkreslení (selection bias) • charakteristiky osob ve výběru se systematicky liší od charakteristik cílové populace • studie případů a kontrol – případy a kontroly vybírány do studie různým způsobem • kohortové studie – výběr dobrovolníků (motivace), rozdílné počty ztrát ve skupinách Informační zkreslení (information bias) • nepřesnosti vzniklé při sběru dat o expozici či onemocnění • zkreslení vyšetřovanou osobou – např. zjišťování míry expozice dotazníkem či v pohovoru (studie případů a kontrol) • zkreslení pozorovatelem – např. pokud znalost expozice ovlivňuje klasifikaci onemocnění • zkreslení tazatelem – např. pokud tazatel zná hypotézu studie Publikační zkreslení (publication bias) • snadnější publikování určitého typu výsledků (pozitivní, politicky korektní, korespondující s profilem časopisu, .....)

22. Zavádějící (confounding) faktor • činitel, který zkresluje (zesiluje, či zeslabuje) pozorovaný vztah mezi expozicí a onemocněním • faktor (F) má vztah k následku (D) • faktor (F) je asociován s expozicí (E) • faktor (F) není mezikrokem na cestě mezi expozicí (E) a následkem (D) • vliv (F) je umocněn, pokud je rozdílně distribuován ve srovnávaných skupinách • věk • vedlejší expozice (často vliv kouření, alkoholu, výživy)

23. Tabulka 2.10: Asociace mezi konzumací kávy a ischemickou chorobou srdeční v hypotetické studii případů a kontrol - základní tabulka Tabulka 2.11: Asociace mezi konzumací kávy a ischemickou chorobou srdeční v hypotetické studii případů a kontrol - tabulka s ohledem na kouření

24. Biologické expoziční testy • stanovení koncentrací škodlivin a jejich metabolitů v biologickém materiálu člověka (moč, krev, vydechovaný vzduch, vlasy, mateřské mléko, chirurg. odebrané tkáně) • význam zejména při krátkodobém překročení povolených limitů • sledování úrovně vylučování a kumulace dané látky v organismu • sledování individuálního zatížení Biologický limit • povolené koncentrace škodlivin a jejich metabolitů v biologickém materiálu člověka

25. Literatura: Vladimír Bencko, Karel Hrach,Marek Malý, Hynek Pikhart,Jindra Reissigová, Štěpán Svačina,Marie Tomečková, Jana Zvárová; Statistické metody v epidemiologii; na http://ucebnice.euromise.cz

26. Testy na zvířatech(in vivo)

27. Laboratorní zvířata - gnotobiologie Konvenční typ zvířat • nedefinovaná mikroflóra • otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel SPF(Specific patogen free) • mikroflóra zvířat prokazatelně neobsahuje specifické patogeny (salmonela, tuberkulóza,hepatitida, ....), jinak není přesně definována • bariérový chov Axenická (germ-free) • bez mikroflóry v trávícím traktu a na povrchu těla • chov ve sterilním prostředí - bezmikrobní izolátory Gnotobiotická • velmi dobře definovaná střevní mikroflóra • první generace - očkování mikroflóry axenickým zvířatům • chov ve sterilním prostředí - bezmikrobní izolátory

28. Schéma laboratorního izolátoru Boxy pro otevřený a bariérový chov Izolátory Laboratorní zvířata - typy chovů Otevřený • vstup i výstup zvířat, osob i materiálu je bez bariéry Bariérový • prostor pro zvířata je oddělen od vnějšího prostředí a vstup a výstup zvířat, osob i materiálu je možný pouze způsobem zajišťujícím ochranu před průnikem nežádoucích vlivů z vnějšího prostředí (sterilizace vody, potravy, podestýlky, osobní hygiena zaměstnanců) Izolátorový • prostor pro zvířata je trvale oddělen bariérou od vnějšího prostředí a osob, které se zvířetem manipulují

29. Laboratorní zvířata - genetické aspekty Outbrední populace • populace zvířat křížená tak, aby jedinci byly co nejméně příbuzní • v dané generaci méně než 1% příbuznost Inbreddní kmeny • 20 a více křížení bratr  sestra (rodič  potomek) • geneticky téměř identičtí jedinci F1 hybrid • první generace po zkřížení zástupců dvou inbredních kmenů

30. Laboratorní zvířata - genetické aspekty Kongenní a koisogenní kmeny • inbrední kmen, který se liší od rodičovského kmenu v jednom konkrétním genu - výsledek spontánní mutace, nebo zpětného křížení „Knock-out“ kmeny • mutace výsledkem genetické manipulace • část buněk obsahuje zmutovaný gen Transgenní kmeny • mutace výsledkem genetiké manipulace • v každé buňce je obsažena cizí část DNA • nejčastěji při studiu genotoxicity – zkrácení testu, snížení počtu zvířat

31. Laboratorní myš Zlatý křeček • jako laboratorní zvíře užíván od roku 1930 • používán zejména při testech karcinogenity • průměrná hmotnost 85 - 100 g • průměrná délka života 1.5 - 3 roky • jako laboratorní zvíře užívána od počátku. 20 st. • vyšlechtěno 200 inbredních kmenů, běžně používáno 25 • průměrná váha 20 - 40 g • průměrná délka života 1.5 - 3 roky Laboratorní zvířata - příklady • Laboratorní myš (Mus musculus) 54 % • Laboratorní potkan (Rattus norvegicus) 39 % • Křeček zlatý (Mesocricetus auratus) 2 % • Morče domácí (Cavia apperea) 2 % • Králík domácí (Oryctolagus cuniculus) 2 % • Pes domácí (Canis familiaris) • Prase domácí (Sus scrofa) • Ryby • Obojživelníci • Plazi • Primáti

32. Testy akutní, subakutní, subchronické a chronické toxicity určení vlivu dané látky na zdraví a úmrtnost zvířat při různých délkách a úrovních expozice Test hypersenzibilace pro zjištění schopnosti dané látky vyvolávat vyrážky a další alergické reakce Testy reprodukční toxicity sledování vlivu dané látky na plodnost a porodnost Test fototoxicity pro zjištění zda vystavení dané látky slunečnímu záření vede ke zvýšení její toxicity Testy vývojové toxicity sledování schopnosti dané látky vyvolávat abnormality ve vývoji plodu a novorozence Toxikokinetické studie sledování absorpce, distribuce, biotransformace, depozice a exkrece dané látky Testy akutní a chronické oční a kožní dráždivosti sledování schopnosti dané látky dráždit a leptat kůži nebo oko Behaviorální testy sledování vlivu chemikálií na kognitivní funkce (učení) organismu během vývoje a v dospělosti Standardní testy toxicity prováděné na laboratorních zvířatech Go a Fraizer (1989)

33. Akutní orální toxicita • škodlivý účinek látky, který se projeví po orální aplikaci jedné dávky, nebo několika dávek v krátkém časovém úseku (max 24 h) Dávka • hmotnost látky (mg), nebo hmotnost látky přepočtená na jednotku tělesné hmotnosti modelu (mg/kg) Střední smrtelná (smrtná) dávka - LD50 • množství škodliviny, které způsobí úhyn 50% pokusných zvířat během definovaného období po jednorázové aplikaci Křivka dávka - účinek • závislost mezi dávkou a procentem populace vykazující studovaný efekt

34. Žaludeční sonda • podání látky sondou přímo do žaludku zajišťuje enterální aplikaci celé dávky • látka se nemůže vstřebat parenterálně např. na sliznici pod jazykem • látka neobchází jaterní detoxikační bariéru („first pass effect“) Akutní orální toxicita Klasický test • nejčastěji používané modely potkan (OECD guideline 401) nebo myš (OECD guideline 402) - konvenční typ • sledovaná látka podávána sondou přímo do žaludku • několik úrovní dávek ( 3), každá dávka několika zvířatům ( 5) • doba pokusu 14 dní  • LD50odhadnuta z křivky dávka - účinek (v úvahu se bere počet úmrtí a pitevní nálezy)

35. Akutní orální toxicita„Fixed dose method“ • OECD guideline 401, experiment složen ze dvou částí Orientační (Sighting) studie • každá z fixních dávek 5, 50, 500 a 2000 mg/kg podána jednomu zvířeti • v oblasti mezi netoxickou a smrtelnou dávkou možno provést zpřesnění • cílem je stanovit iniciální dávku (vyvolávající prokazatelné tox. účinky, ale ne smrt) pro hlavní studii Hlavní studie • iniciální dávka podána 10 zvířatům (5 samců, 5 samic) • na základě projevů intoxikace se pokračuje s vyšší nebo nižší dávkou • nesleduje se počet úmrtí, ale projevy toxického účinku

36. Akutní orální toxicita„Acute toxic class“ • OECD guideline 423 • pokus sestává z 2 - 4 kroků • v prvním kroku je 3 zvířatům stejného pohlaví podána jedna z dávek 25, 200 nebo 2000 mg/kg • podle reakce na první dávku experiment pokračuje • stejná dávka zvířatům opačného pohlaví • vyšší nebo nižší dávka zvířatům stejného pohlaví • experiment končí • výsledkem testu není přesné určení LD50 , pouze zařazení látky do třídy toxicity

37. Akutní orální toxicita„Up and Down procedure“ • OECD guideline 425 • v prvním kroku je 1 zvířeti podána dávka odpovídající kvalifikovanému odhadu LD50 • pokud v 1 kroku zvíře zemře (vykazuje zřetelné projevy akutní intoxikace) je dalšímu zvířeti podána dávka nižší a naopak • experiment pokračuje do nalezení hraničních dávek - z nich je proveden přesnější odhad LD50 • výsledkem testu je přesný odhad LD50

38. Zařízení pro test head / nose-only Akutní inhalační toxicita • testování toxicity plynů, par a aerosolů (OECD guideline 403) Střední smrtelná (smrtná) koncentrace - LC50 nebo CL50 • koncentrace škodliviny v nadýchaném vzduchu, která způsobí úhyn 50% pokusných zvířat po 4h expozici během definovaného období po ukončení aplikace • při testu akutní inhalační toxicity je pokusný objekt umístěn v inhalační komoře, v prostoru s inhalovanou látkou pouze budˇpouze hlava (head/nose - technique) nebo celé tělo (whole body technique) • znehybnění zvířat, regulace plicní ventilace • Alternativní test (OECD guideline 433) - „Fixed dose method“

39. Akutní dermální toxicita • testování látek, u nichž je předpokládána významná kožní expozice • OECD guideline 402 Střední smrtelná (smrtná) dávka LD50 nebo DL50 • aplikace dermálně • látka se nanáší na na pokožku zvířete, která byla 24 h před aplikací depilována • depilovaný prostor max. 10 % povrchu těla • zvíře fixováno, aby nanesenou látku neolizovalo

40. Akutní dermální dráždivost • OECD guideline 404 • účinek látky na depilovanou pokožku • nejčastěji používán albinotický králík • pozorované změny reversibilní (zánět), nebo ireversibilní (poleptání) • na 6 cm2 depilované kůže se nanese 0,5 g nebo 5 ml testované látky, po 4 h se látka smyje vodou a hodnotí se změny v místě aplikace • pozorování se provádí po 1/2 h;1 h; 1; 2; 3 nebo až 14 dnech • poškození se hodnotí podle dohodnuté stupnice

41. Akutní podráždění oka • OECD guideline 406 • nejčastěji používán albinotický králík • do spojivkového vaku oka zvířete se aplikuje 0,1 g nebo 0,1 ml látky • po 24 h se oko vymyje vodou a pozorují se změny • pozorování se provádí po 1, 24, 48 a 72 h • poškození se hodnotí podle dohodnuté stupnice • k vyhodnocení lze použít optické přístroje binokulární lupa, štěrbinová lupa, mikroskop

42. Testy na subakutní a subchronickou toxicitu • test subakutní toxicity obvykle 28 dní, test subchronické toxicity obvykle 90 dní • aplikace orální, dermální, nebo inhalační • dávka sledované látky odpovídá 1/10 LD50 , koncentrace 1/10 LC50 • tři skupiny pokusných zvířat - pokusná, kontrolní, volně držená • pokusná – ustájená v bariérovém nebo izolátorovém chovu, přesně definované podmínky a strava, podáváme jí toxickou látku • kontrolní - je ustájena za stejných podmínek jako pokusná, stejná strava, nepodáváme toxickou látku (slouží k odlišení zdravotních defektů vznikajících přirozenou cestou od těch, které jsou vyvolány sledovanou chemikálií • volně držená – v bezbariérovém chovu (slouží k vyhodnocení vlivu životních podmínek na zdravotní stav pokusných zvířat – např. stres) Parametry sledované v průběhu pokusu: • hmotnost, úmrtnost, spotřeba potravy a vody, chování zvířete, metabolismus, mechanismus a rychlost vylučování, fysiologická vyšetření, biochemická šetření, reprodukční schopnosti • po ukončení pokusu se pokusná a kontrolní skupina utratí a provede se pitva

43. Testy na chronickou toxicitu • uspořádání testu stejné jako u testu subakutní toxicity • expozice dané látce probíhá po většinu doby života lab. zvířete • chronické testy se používají pro zjištění mutagenních, karcinogenních a teratogenních vlastností látek

44. Alternativy klasických testů (3R, testy in vitro,.....)

45. 3R Replacement (náhrada klasických testů) • využití databází a počítačových programů – QSAR, rešerše, ........ • testy „in vitro“ - tkáňové kultury, bílé krvinky, jaterní buňky, testy na nižších organismech (bakterie, prvoci, bičíkovci, řasy, červi, houby, kvasinky, hmyz, semena rostlin) Reduction (snížení spotřeby laboratorních zvířat) • racionální a efektivní využití laboratorních zvířat • screeningové a pilotní studie • vhodný statistický design studie • v některých případech užití inbredních kmenů zvířat • použití technik „Acute toxic class“ „Up and dovn procedure“ „Fixed dose method“......... Refinement (zjemnění) • provádět testy tak, aby docházelo k co nejmenšímu utrpení zvířat

47. In Vitro testy • In vitro testy typicky slouží k zjišťování jiného typu dat než In vivo • studium interakce toxická látka – receptor • mechanistická toxikologie – studium biochemických mechanismů účinku • studium genotoxicity na buněčné úrovni • In vitro lze též použít jako náhradu testů In vivo • nutný proces validace – ověření shody výsledků obou metodami Pomocí testů In vitro lze nahradit následující In vivo testy • test akutního podráždění oka (buněčná kultura z oka kuřete či králíka) • test akutního podráždění kůže (lidská kožní buněčná kultura) • test neurotoxicity organofosfátů na kuřeti • imunologické testy, Pomocí testů In vitro nelze získat následující informace • toxikokinetika • systémové účinky • křivka dávka – účinek • orgánová toxicita

48. In Vitro testy Výhody • kontrolované a nastavitelné podmínky experimentu (minimalizace počtu proměnných) • systémové efekty nezkreslují výsledky experimentu • vysoká míra homogenity výsledků • testy jsou rychlé a levné • potřeba malého množství testované látky – minimalizace odpadů • možnost používat lidské buňky a orgány • možnost používat geneticky modifikované buňky Nevýhody • nemožnost získat některé typy údajů • problematická platnost některých dat pro zvířata a lidi • etické problémy

49. Yes Yes Yes Yes Selection and Use of Replacement Methods in Animal Experimentation(The Universities Federation for Animal Welfare (UFAW), 1998) Is there any information available which allows you to select a replacement alternative to achieve some or all of your objectives? Where only some of your objectives can be achieved by using replacement alternatives, this can contribute to an overall reduction in the numbers of animals used. Consider parallel animal/non-animal experiments for the validation of alternatives for your purposes. Consider whether the results of experiments using replacement alternatives can improve any subsequent or complementary animal studies. Use the alternative No No Have you done a specific literature search to include replacement alternative methods? Conduct a search Yes Is there any information allowing you to select a replacement alternative to achieve some or all of your objectives? Use the alternative No Can any existing replacement alternatives be adapted or can you develop new alternatives to accommodate your needs without compromising scientific integrity? Adapt and use the alternative No Can you modify your research strategy to allow you to use a replacement alternative for some stages of your work? Modify strategy No Consider implementing reduction and refinement alternatives. Consult a veterinarian, a statistician, an animal welfare officer.

50. Krátkodobé (screeningové) testy mutagenity Reverzní testy • využití zpětných mutací (reverze) • působením známého mutagenu nejprve vytvoříme bakteriální kmen, který není schopen syntetizovat některý pro život nezbytný metabolit (auxotrofní bakterie) • tento auxotrofní kmen pak použijeme k testování mutagenity sledované látky Amesův test • využívají se histidin auxotrofní kmeny Salmonela typhimurium, které se nejsou schopné množit bez přítomnosti histidinu • působením mutagenní látky (metabolitu) dojde ke zpětné mutaci a mutanti jsou schopni histidin syntetizovat - množí se bez vnějšího zdroje histidinu, na misce narůstají kolonie • v případě, že testovaná látka není mutagenní, auxotrofní kmen spotřebuje vnější zásobu histidinu a postupně vyhyne • rychlý levný test, výsledky ne vždy plně přenositelné na člověka