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iGEM Chiba 2009

iGEM Chiba 2009. E. Coli Time Manager Since 2008. iGEM CHBA 2009 の目標. 昨年度作成した時間差スイッチ. ・ 別々の入力であるため、 　同一系内での時間の流れを表現することができない。 ・１通りの時間差しか生み出せていない。 ・蛍光強度の上昇し始めに差が見られない。. ０９ CHIBA は流れと精確性のある時間差スイッチをつくる！. 時間の流れをつくるには. 並列型. 直列型. 並列型作成案. 直列型作成案. デモンストレーション向け実験. 並列型案①： LuxR Mutant.

andrew
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Presentation Transcript

  1. iGEM Chiba 2009 E. Coli Time Manager Since 2008

  2. iGEM CHBA 2009 の目標 昨年度作成した時間差スイッチ ・別々の入力であるため、 　同一系内での時間の流れを表現することができない。 ・１通りの時間差しか生み出せていない。 ・蛍光強度の上昇し始めに差が見られない。 ０９CHIBAは流れと精確性のある時間差スイッチをつくる！

  3. 時間の流れをつくるには 並列型 直列型

  4. 並列型作成案

  5. 直列型作成案

  6. デモンストレーション向け実験

  7. 並列型案①：LuxR Mutant 寺久保先輩が作成しているLuxRMutantをお借りして、並列回路を作ろうと考えています。 Rapid GFP Plux Wild type LuxR Dyll luxR Sensitive luxR Normal AHL Plux GFP Delay Plux GFP luxR luxR luxR luxR luxR luxR

  8. 並列型案①：LuxR mutantMutant 選別実験 現状：約10000個（種類）のMutantプラスミド懸濁液 1, プラスミド混濁液を、元々pLux-GFPが入った株でtransformationする。 2, 各コロニーを96deepwellで液倍し、１sampleあたり、 4種類のAHL濃度（0, 1, 10, 100nM）×3＝12wellを使って培養。 30分毎に、蛍光強度を計測。 この時、Wild typeのLuxRもN.C.として培養＆計測する。 Q1、いくつSampleを扱えばいいのか？ Q2、何分ごとに蛍光強度を測定するのがベストなのか？ Q3、濃度の段階はどの間隔がベストなのか？

  9. 並列型案①：LuxR mutantMutant parts 作成実験 Wild type よりも30分以上蛍光強度上昇の様子が早まったor遅れたモノだけ PCRでbiobrick仕様の制限酵素サイトをつけ、p15Aのプラスミドにのせる。 P15A LuxR mutant Q、ポジティブフィードバックは使えないのではないか。

  10. 並列型案②：細胞内カスケード pLac LuxI pTet pLux pLac LuxR LacⅠ CⅠ pλCⅠ GFP

  11. 直列型案：細胞外カスケード 最終的に並列回路と同時に起動させたいので 最初のスイッチは LuxI（OHHL）で統一 pLac-LuxR pTet-LuxR pLux-GFP-??? pTet-??? p???-GFP LuxI（OHHL）とクロストークしない組み合わせで 細胞外カスケードを作り、時間差を生み出す。

  12. 直列型案：細胞外カスケードクロストークしない組み合わせ直列型案：細胞外カスケードクロストークしない組み合わせ LuxI protein family syntheses from Staphylococcus aureus AIP receptor and activator of P2 promorter agrA agrC agrB agrD From 07Cambridge

  13. 直列型案：細胞外カスケードシステム構成案 Las型/ペプチド型 弐号機 初号機 零号機 pTet-LuxR pLux-LasI-Reporter pTet-LasR pLas-Reporter pLac-LuxI pTet-LuxR-AgrB pLux-AgrD pTet-AgrA-AgrD pLas-Reporter

  14. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験 零号機 : LuxI(Sender) BBa_K084012 を使用。 plac LuxI 初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) 作成が必要。 ptet LuxR plux GFP LuxI LasI 初号機 : pLuxの漏れ対策版 作成が必要。 ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI 弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter 作成が必要。 ptet LasR plas GFP LasI

  15. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験① LuxR-LasI 初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender) ptet LuxR plux GFP LuxI LasI T9002 ptet LuxR plux GFP C0061 LuxI C0178 LasI 1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。（Reverseプライマーデザイン必要） 2, C0061（LuxI）をつなげる。 3, ポジティブフィードバックの効果測定 4, C00178を作成して完成

  16. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験①ポジティブフィードバック効果調査 T9002 ptet LuxR plux GFP 作成したパーツ ptet LuxR plux GFP LuxI ①誤作動の有無の確認 AHLを加えない状態で培養し、GFPの漏れの有無を調べる。 　　誤作動が見られた場合→ plux/lacO 版を作成 or Las型パーツ作成中止 ②効果の有無の確認 T9002（元のパーツ）との蛍光強度の上がり方を比較する。

  17. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型　パーツ作成実験① 漏れ対策pLax/lacO 初号機 : pLuxの漏れ対策版 ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI C0061 LuxI C0178 LasI S03600 pTet LuxR C0012 LacI K091100 plux/lacO E5501 RBS+GFP ３とおりのパーツ作成方法 1, 3ステップでつなげる 2, 部分的に合成する。 3, 前合成する。

  18. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験② 弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter ptet LasR plas GFP LasI R0040 pTet K091118 LasR plas GFP C00178 LasI 1, K091118からPCRで下流のターミネーターを取り除く。 　 （Reverseプライマーデザイン必要） 2, R0040をつなげる。 3, さらにC00178をつなげて完成。

  19. 直列型案：細胞外カスケード Lux-Las型LasCheck Plac LasI Ptet LasR Plas GFP

  20. 見せるための実験①：AHL拡散の様子＠固体培地見せるための実験①：AHL拡散の様子＠固体培地 ・LuxI：OHHLのチェック BBa_T9002を導入した大腸菌を撒いた固体培地にOHHLを滴下し、 各コロニーの蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する ・LasI：OdDHLのチェック BBa_K091134を大腸菌に導入し、 IPTGを入れた固形培地に撒いてOdDHLを滴下して各コロニーの 蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する

  21. 見せるための実験②：複数のレポーターの準備見せるための実験②：複数のレポーターの準備 初号機のGFP部分の色違いのパーツです。 赤色:BBa_I731012 Ptet LuxR plux RFP 黄色:BBa_K084003 Ptet LuxR plux YFP これらに初号機（BBa_T9002）と同様にLuxI:BBa_C0061、LasI:BBa_C0178をつけることによって蛍光色のバリエーションを作ろうと思っています。

  22. 直列型案：細胞外カスケード ペプチド型パーツ作成実験 零号機 : LuxI(Sender) BBa_K084012 を使用。 plac LuxI 初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender ptet LuxR plux GFP AIP Sender 作成が必要。 弐号機 : AIP Detector(Receiver) + Reporter AIP Detector + Reporter I746220 作成不要 作成が必要。

  23. 直列型案：細胞外カスケード ペプチド型パーツ作成実験 初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender ptet LuxR plux GFP AIP Sender T9002 ptet LuxR plux GFP I746009 AIP Sender 1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。（Reverseプライマーデザイン必要） 2, I746009つけてかんりょう

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