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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 14

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi. BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 14. +/-. +/-. ERE 2x. INSULATOR ( MAR ). firefly luciferase. INSULATOR ( MAR ). TK. light. luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP +. ERE-Luc reporter mouse.

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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 14

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Presentation Transcript

  1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 14

  2. +/- +/- ERE 2x INSULATOR ( MAR ) firefly luciferase INSULATOR ( MAR ) TK light luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + ERE-Luc reporter mouse ERE The ERE-Luc reporter mouse: a model tostudyof ER transcriptionalactivity kinase-dependent activation Ciana et al., 2001

  3. 6 6 4 4 bone bone ovaries ovaries 4 4 2 2 2 2 0 0 0 0 9 9 20 20 brain brain uterus uterus 7 7 15 15 5 5 10 10 3 3 5 5 1 1 0 0 LUCIFERASE ACTIVITY (RLU) 4 4 12 12 thymus thymus hypothalamus 3 3 2 2 6 6 E M D P 1 1 0 0 0 0 20 20 16 16 intestine intestine liver liver 12 12 10 10 8 8 4 4 0 0 P E M D2 0 0 P P E E M D2 D P P E E D D2 ERE-Luc mouse Luciferase activity in adult, cycling females /ml) ESTRUS S 50 5 pg 0 40 ( 4 E2 (pg/ml) 0 30 3 Estradiol 0 20 2 0 10 10 day 1 M day 2 D day3 P day 4 E Ciana et al, Nature Ned., 2003

  4. THE COMPLEXITY OF ESTROGEN ACTION THE COMPLEXITY OF ESTROGEN TARGETS • REPRODUCTIVE SYSTEM • - male and femalegonads • - hypothalamus and pituitary • SKELETAL SYSTEM • VASCULAR SYSTEM • - endothelium • smoothmusclecells • RESPIRATORY SYSTEM • IMMUNE SYSTEM • NERVOUS SYSTEM • - central • - peripheral G-protein, IP3K... SP1 NFKB AP1 ERE

  5. ER COMPLEXITY OF ACTION and A NEW CLASS OF DRUGS: Selective Estrogen Recepor Modulators CNS cardiovascular reproductive growthfactors P bone SP1 NFKB AP1 tissue-specific coregulators ERE

  6. ESTROGEN REPLACEMENT THERAPY The efficacy of SERMs on estrogen receptor transcriptional activity was measured in a model of surgical menopause (ovx mice) SERMs ability to replace the natural hormone was evaluated by comparison with ER activity in healthy, cycling mice

  7. Measuringbioluminscence in the ERE-Luc reporter mouse Thymic area Hepatic area Bioluminescenceafter 6h treatment with 15b-estradiol (50ug/kg) Reproductiveorgans (mammari glands and vagina) Intestine Muscle-Skeletal System

  8. days of treatment pellet CONTROLS REFERENCE DRUG DRUG OF INTEREST In vivo analysis of photon emission Manual Automatic Rando et al. 2009

  9. REPORTER MICE TO STUDY DRUG ACTION “IN VIVO” VAGINA CHEST Photonemission Luciferaseenzymaticactivity Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Biserni et al, in preparation

  10. EffectsofSERMs on ER activity – in vivo imaging CHRONIC treatment (21 days) ** ° Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Biserni et al, in preparation

  11. EffectsofSERMs on ER activity – in vivo imaging CHRONIC treatment (21 days) Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Biserni et al, in preparation

  12. TAIL LIMB ACUTE CHRONIC Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

  13. HEPATIC AREA ABDOMEN ACUTE CHRONIC Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

  14. SERCHING FOR NOVEL MODALITIES TO MEASURE THE EFFICACY OF SERMs N° peaks, amplitude, frequency AUC

  15. GENITAL AREA SKELETAL AREA * * * * * A Peaks/21d * * * * Amplitude B * Period (d) C * * * * * AUC * D Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010 * * * * E Potency * *

  16. PHENETICS OF DRUG ACTION THE APPLICATION OF AGGLOMERATIVE HIERARCHICAL CLUSTERING (AGGLOMERATIVE NESTING version 1.02 )

  17. DEGREE OF FUNCTIONAL CORRELATION AMONG THE PARAMETERS SELECTED a b Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

  18. Space-temporal analysis of drug action in living animals clustering data to generate novel families of compounds Genital area Skeletal area Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

  19. C Reverse Medicinal Chemistry A Genital area B Skeletal area Cl Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

  20. …IL MEDICO ADOPRERA’ BENE LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’ CHE COSA E’ OMO, CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE, CHE COSA E’ SANITA’…

  21. ectoderm endoderm mesoderm 13.5 14.5 16.5 18.5 12.5 P1 dpc (day post conception) post-natal day 1 ERE-Luc mouse imaging IHC F C D A B C – intestine 20x D – bone 40x E – heart 40x F – forebrain 10x G – moustache 40x H – skin 20x G E H 16.5 dpc 16.5 dpc GP Rando, 2007

  22. 13.5 14.5 15.5 16.5 18.5 ERE-Luc mouse dpc (day post conception) ER istranscriptionallyactive at day 14.5 pc

  23. Pregnancy & Embryo Development 19.5 DAY 1 18.5 DAY 10 DAY 18.5 LIFE 17.5 DAY 16.5 CYCLE 16.5 DAY 15.5 15.5 DAY 14.5 14.5 13.5 Immature DAY 13.5 Mice 12.5 AdultMice ERE-Lucmicetounderstand ER involvement in mammalsphysiopathology SucklingMice

  24. The real impact of molecular engineering on drug discovery “The whole is more than the sum of its parts “ Aristotle (384 BC – 322 BC) Methapysics MODERN PHARMACOLOGY NEEDS TO REVISIT ANIMAL MODELS

  25. FARMACI BIOTECNOLOGICI PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE ACIDI NUCLEICI per la regolazionedellaespressionedispecificigeni

  26. VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI ANTI-ACIDI NUCLEICI BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO Numero di proteine intracellulari: 1000-100000 Numero di RNA: 100-10000 Numero di geni: 1-2 AZIONE MOLTO SPECIFICA Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick

  27. ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI TRASCRIZIONE MODIFICAZ. TP TRADUZIONE 3’ RNA, trascritto primario Capping e poliadenilazione Splicing o maturazione Fuoriuscita dal nucleo riconoscimento da parte dei ribosomi • traduzione • Modificazioni post-traduzionali

  28. La rilevanza dei processi di regolazione della espressione genica nel disegno di nuovi farmaci L’omeostasicellulare è mantenutada un efficientecontrollodellatrascrizionegenicachevieneassicuratoda un complessocircuitomolecolarecheutilizzafattoriditrascrizioneindividali, l’apparatobasaleditrascrizionee icomplessimultiproteicicoregolatoridellatrascrizione.

  29. La cromatina ha un ruolofondamentalenellareglazionedellaespressionegenica e la capacitàdegliistonidilegareil DNA è regolatadaenzimiintranuclearichepossonoapportaremodificazioni post-traduzionalisoprattuttoairesiduidilisina e argininapostineldominio N-terminaledelleproteineistoniche Modificazionidegliistoni: acetilazione, fosforilazione, metilazione, ubiquitinazione

  30. MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360

  31. Metilazionedegliistoni La metilazionedegliistoniaumenta lo statodiidrofobicità e la basicitàdelleporzioni N terminalidegliistoni: questo ne aumental’affinità per proteinespecifiche e fattoriditrascrizione. Le metilasinecessitanodicofattori: es. la s-adenosilmetionina Generalmente la metilazionedegliistonisiassocia a repressionedellaespressionegenica, tuttaviacisonoesempi in cui la metilazionesiassocia a attivazionedellaespressionegenica (metilazionelellalisina 4 dell’istone 3, ilcoattivatore CARM1 è unametiltransferasi)

  32. PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DELLA CROMATINA ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE ASSOCIATA CON ACETILAZIONE

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