Rompimento não-Mecânico

1. Rompimento não-Mecânico 1) Choque Osmótico • Não ocorre rompimento total das células; • Pode propiciar a permeabilização seletiva; • As células são mantidas por 30 minutos em meio com concentração de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC. • Mais indicado para bactérias Gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensível que as Gram-positivas.

2. Rompimento total e permeabilização seletiva

3. Congelamento-descongelamento • As células passam por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la formando poros permeáveis à biomolécula-alvo. • Fatores que mais influenciam: • tipo e idade da célula; • Temperatura • Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

4. Congelamento-descongelamento • Método de difícil implantação em grande escala • Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas

5. Termólise • Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier. • Sãos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido à sua simplicidade; • Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana; • Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimensões e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou centrifugação.

6. Termólise • Exemplos: • Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberação de enzimas intracelulares • Uma suspensão de Bacilusmegateriumnas mesmas condições proporciona o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)

7. Rompimento Químico • Álcalis: • Adequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11 • Método simples e de baixo custo; • Ocasiona geração de poluentes;

8. Rompimento Químico • Detergentes: • São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo; • A célula pode ser totalmente rompida; • Ex.: lauril sulfato de sódio, Triton, etc. • Formação de espuma e desnaturação e/ou precipitação de proteínas

9. Rompimento Químico • Solventes: • Consiste na desidratação das células, sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona; • Adequado para biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente empregado;

10. Rompimento Químico • Lise enzimática: • Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmática é rompida pela pressão osmótica interna, após a parede celular, ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado. • Adequado para recuperação de biomoléculas sensíveis ao rompimento mecânico, temperatura, tensão de cisalhamento e elevadas pressões. • Fatores a ser considerados: presença de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima.

11. Rompimento Químico • Sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de microrganismo: • Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais hidrolisam componentes específicos da parede, como glucanas, proteínas e mananas. • Bactérias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligações covalentes da estrutura do peptideoglicano

12. Parede Celular BacterianaPeptideoglicano • Ex.: lisozima, catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas do peptideoglicano, mais eficiente no rompimentos de bactérias Gram-positivas.

13. Preservação da Biomolécula-alvo • Adição de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da degradação de proteínas); • Adição de agentes redutores (para evitar a oxidação dos sítios ativos das enzimas após o rompimento); • Adição de nucleases ou proteases podem melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse; • Alteração de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

14. Etapas de um Processo de Purificação Baixa resolução Alta resolução

15. Métodos de Purificação de Baixa Resolução • Precipitação • Separação por membranas • Extração em sistemas de duas fases líquidas

16. Precipitação

17. Precipitação • Um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação; • É um método moderado de purificação já que não apresenta elevada capacidade de separação de diferentes proteínas; • Métodos agressivo para recuperação de proteínas, pois sua função tridimensional é modificada, e a função bioquímica de uma proteína depende de sua estrutura; • É viável quando a função bioquímica é recuperada após a precipitação

18. Precipitação

19. Estrutura das Proteínas • Constituição • Aminoácidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas. • Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução.

20. Estrutura das Proteínas • Estruturaprimária: refere-se à seqüência dos aminoácidos na cadeia linear peptídica. • Estruturasecundária: refere-se ao grau de ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

21. Estrutura das Proteínas • Estruturaterciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária. Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína. As estruturas secundária e terciária conferem à proteína a sua estrutura tridimensional.

22. Estrutura das Proteínas Estruturaquaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas. Para sua estabilização concorrem ligações iônicas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes bissulfeto e interações hidrofóbicas.

23. Região Hidrofóbica (Apolar) Regiões Hidrofílicas (Polares) Determina sua solubilidade • Solubilidade de Proteínas Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.

24. Solubilidade: resultado global das interações atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e soluto; • É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e solvente; • Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals;

25. pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos; • Carga total zero leva ao  da agregação devido à  repulsão => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH • O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.

26. + + - - pI • pH e distribuição de cargas: De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

27. A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso. - as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas. Desnaturação X Precipitação • A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína. - as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.

28. A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja recuperada, para que a mesma possa “exercer” sua função bioquímica após o processo.

29. Precipitação por sais • Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação • Salting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água que tornam-se escassas e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas, que expostas interagem e se agregam. • Os sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio.

30. Salting-in: redução na concentração de sais induz interações iônicas e agregação entre moléculas de proteína. Globulinas se precipitam sob força iônica baixa Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (saltingout)

31. Precipitação por solventes • A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula; • Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros: precipitantes; • Deve ser miscível em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bom precipitante; • Mais usados: metanol, etanol e acetona;

32. Mecanismo Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.

33. Variáveis que afetam o processo • Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a desnaturação < 0º C podem garantir que não haja desnaturação adição do solvente  temperatura => deve ser lenta e sob refrigeração • pH: próximo ao pI favorece a precipitação

34. Precipitação por polímeros • PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar, neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização; • Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%); • 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes • Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso; • Concentração depende do tamanho da molécula a ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína; • Remoção do polímero: ultrafiltração, adição de etanol, separação pela formação de duas fases aquosas pela adição de sais.

35. Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual; • Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico, utilizados para precipitar ácidos nucléicos e proteínas. • Mecanismo: Ocorre a agregação à proteína (floculação) ou eletrostático (neutralização de cargas); a proteína e o polieletrólito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se operar longe do ponto isoelétrico da proteína. • Precipitação pela temperatura • Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação => exposição de grupos hidrofóbicos que interagem e formam complexos insolúveis;

36. Precipitação isoelétrica • Resulta da atração eletrostática das proteínas quando estas estão próximas a seu pI; • Método bastante simples: ajuste do pH • Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas; • Vantagem: baixo custo • Desvantagem: possibilidade desnaturação • Obs.: Método útil para precipitar proteínas indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;