4. Enzymy, funkce, biologický význam juang.bst.ntu.tw/BCbasics/Animation.htm#Enzyme

1. 4. Enzymy, funkce, biologický významhttp://juang.bst.ntu.edu.tw/BCbasics/Animation.htm#Enzyme

4. Enzym - makromolekula, obvykle protein, často obsahující nebo vyžadující jeden nebo více kovových iontů, která působí jako (bio)katalyzátor zvýšením reakčního toku. Enzym obecně katalyzuje pouze jeden typ reakce (reakční selektivita) a působí pouze na omezenou množinu substrátů (nebo jen na jeden substrát, substrátová selektivita). Molekuly substrátu se transformují na stejném místě (regioselektivita, regionální selektivita) a transformuje se pouze jeden substrát nebo preferenčně jeden z enantiomerů nebo chirálních substrátů nebo racemických směsí (enantioselektivita, speciální forma stereoselektivity).Zdroj: Glossary of terms used in medicinal chemistry, IUPAC Recommendations 1998, Zdroj: Glossary of terms used in bioinorganic chemistry, IUPAC Recommendations 1997.

10. Enzym Substrát Přechodový stav Produkt Pokud by enzym pouze vázal substrát, žádná další reakce by neproběhla X Enzym nejen že rozpoznává substrát, ale také indukuje formování přechodového stavu Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

11. Povaha enzymové katalýzy B A ●Enzym poskytuje katalytický povrch ●Tento povrch stabilizuje přechodový stav ●Transformuje přechodový stav na produkt B A Katalytický povrch Juang RH (2004) BCbasics

12. Enzym stabilizuje přechodový stav Směr reakce Změna energie ST Energie potřebná bez katalyzování Pokles energie při katalyzování EST S ES P EP T = Transition state Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

13. Aktivní místo hluboce zanořená kapsa Proč je energie požadovaná k dosažení přechodového nižší v aktivní m místě enzymu? Je to tajemná kapsa! (1) Stabilizuje přechod + (2) Odpuzuje vodu CoE (2) (1) (3)Reaktivní skupiny (4) - (4) Spolupráce koenzymu (3) Juang RH (2004) BCbasics

14. Aktivní místo enzymu je hlubší než při vazbě protilátky Naopak aktivní místo enzymu nejen že rozpozná substrát, ale také komplementárně umožňuje vznik přechodového stavu a stabilizuje ho. Vazebné místo antigenu se váže komplementárně na protilátku, bez další reakce. X Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

15. Aktivní místo zabraňuje vlivu vody + - Odstranění vlivu vody umoňuje vznik stabilních iontových vazeb Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.115

16. Reakce katalyzované enzymy • rychlosti enzymových reakcí jsou vyšší o 6 až 12 řádů než rychlosti odpovídajících reakcí bez katalyzátorů a nejméně o několik řádů vyšší, než odpovídajících reakcí katalyzovaných chemicky • reakce probíhají za teplot pod 100 °C, při atmosférickém tlaku a při téměř neutrálních hodnotách pH • reakce mají málokdy vedlejší produkty, enzymy mají vysokou specifitu k substrátům a tvoří mnohem specifičtější produkty • katalytické schopnosti enzymů ovlivňují další sloučeniny (allosterická regulace, kovalentní modifikace enzymu)

19. Allosterický enzym (allosteric enzyme) - enzym obsahující oblast, oddělenou od místa vazby substrátu, na niž se mohou vázat malé regulační molekuly (efektory) a ovlivňovat katalytickou aktivitu enzymu. Efektory se označují jako aktivátory nebo deaktivátory (inhibitory). Efektorová molekula nemusí mít strukturální vztah k substrátu nebo může být druhou molekulou substrátu. Allosterická regulace je regulace aktivity alosterickým enzymem. Allosterická vazebná místa (allosteric binding sites) mohou obsahovat nejen enzymy, ale také receptory, důsledkem může být zvýšená nebo redukovaná interakce molekuly s normálním ligandem.

20. Enzymová indukce (enzyme induction) - proces, kdy se syntetizuje indukovatelný enzym jako odpověď na působení specifické molekuly induktoru. Induktorová molekula (obvykle substrát vyžadující katalytickou aktivitu indukovatelného enzymu k tomu, aby byl metabolizován) se obvykle kombinuje s represorem, což zabraňuje blokování operátoru represorem a výsledkem je translace genu pro enzym Proces, kdy se syntetizuje indukovatelný enzym jako odpověď na působení specifické molekuly induktoru

21. Enzymová represe (enzyme repression) - situace při které je syntéze enzymu zabráněno molekulou represoru. V mnoha případech působí koncový produkt řetězce syntézy (např. aminokyselina) jako zpětnovazební korepresor kombinací s intracelulárním aporepresorovým proteinem, takže tento komplex je schopen blokovat funkci operátoru. Výsledkem je zabránění transkripce do mRNA a exprese všech enzymů nezbytných pro syntézu koncového enzymu je ukončena. Situace při které je syntéze enzymu zabráněno molekulou represoru.

22. Enzymová kinetika

23. Enzymová kinetika • Reakce katalyzované enzymy jsou saturovatelné (jako například membránový transport) • Při vysokých koncentracích substrátu mají reakci kinetiku nultého řádu – nezávislou na koncentraci substrátu

24. Enzymová kinetika E S Teorie Steady State E E + + P S Ve steady state se udržuje stejný tok produkce a odčerpávání přechodového stavu, takže je konstantní koncentrace přechodového stavu. Juang RH (2004) BCbasics

25. Konstatntní koncentrace ES ve steady state Koncentrace Reakční čas S P ES E Juang RH (2004) BCbasics

26. Kinetika Michaelise a Mentenové Závislost počáteční rychlosti konverze substrátu (S) na produkt (P) při enzymové nebo jiné katalyzované reakci. Nejjednodušší mechanismus k1 k2E + S ↔ ES ↔ E + P k-1 k-2dává při podmínkách počátečního steady state a při [P] = 0 rovnici Michaelise-MentenovéV[S] ν = ------------ Km + [S]kde ν je rychlost konverze (Ms-1), V = k2[E] je maximální tok při [S] = pro určitou koncentraci enzymu/katalyzátoru, k2 je číslo obratu (s-1) a Km = (k-1 + k2)/k1 je Michaelisova konstanta při použitých podmínkách. V případě, že enzym nebo katalyzátor není čistý, [E] se udává jako gl-1 místo M. Rovnice vede k hyperbolické závislosti ν na [S], která se v praxi pozoruje často a dokonce i když [S] není ve velkém nadbytku nad [E].

27. Mnoho léků působí jako inhibitory enzymů Inhibitory se váží reversibilně, inaktivátory ireversibilně Záleží na působení inhibitoru Kompetitivní inhibitory interferují s vazbou substrátu Snížení volného enzymu E –> EI Vysoká koncentrace substrátu zajistí, že se Vmax nezmění Nekompetitivní a smíšená inhibice – inhibitory se váží jak na E tak na ES Akompetitivní inhibitory se váží na ES komplex Snížení koncentrace ES–>ESI Vmax a Km jsou sníženy stejným faktorem Enzymová inhibice

28. Enzyme Inhibition (Mechanism) E + S→ES→E + P + I ↓ EI E + S→ES→E + P + + II ↓ ↓ EI+S→EIS E + S→ES→E + P + I ↓ EIS ← ← ← ↑ ↑ ↑ ↑ Uncompetitive Competitive Non-competitive E Substrate E X Cartoon Guide Compete for active site Inhibitor Different site Equation and Description [I] binds to free [E] only, and competes with [S]; increasing [S] overcomes Inhibition by [I]. [I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favors the inhibition by [I]. [I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] can not overcome [I] inhibition. Juang RH (2004) BCbasics

29. Enzyme Inhibition (Plots) Uncompetitive Competitive Non-competitive Vmax Vmax vo Vmax’ Vmax’ I Direct Plots Km [S], mM Km’ Km [S], mM 1/vo 1/vo 1/vo I I Double Reciprocal Two parallel lines Intersect at X axis Intersect at Y axis 1/Vmax 1/Vmax 1/Vmax 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] Vmax vo I I Km Km’ [S], mM =Km’ Vmax unchanged Km increased Vmax decreased Km unchanged Both Vmax & Km decreased I Juang RH (2004) BCbasics

31. Izoenzymy • mnohočetné formy enzymů s rozdílnou primární strukturou determinovanou geneticky • katalyzují stejnou reakci • mají odlišné fyzikální a chemické vlastnosti • mohou pocházet z různých orgánů (například ALP), různých buněčných kompartmentů (AST) nebo i ze stejných buněčných komparmentů (LD) • termín se nepoužívá v situacích, kdy dochází k modifikacím stejné primární sekvence (izoforma). • izoformy naproti tomu pocházejí ze stejného genu, ale jsou výsledkem posttranslační modifikace molekul

34. EC nomenklatura enzymů (EC nomenclature for enzymes) je klasifikace enzymů podle Enzyme Commission IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Enzymům jsou přidělena čtyři čísla, z nichž první definuje typ katalyzované reakce, další dvě definují substráty a čtvrté je katalogové číslo. Kategorie enzymů jsou EC 1, oxidoreduktázy, EC 2, transferázy, EC 3, hydrolázy, EC 4, lyázy, EC 5, izomerázy, EC 6, ligázy (syntetázy)

36. Syntáza (synthase) je enzym, který katalyzuje reakci, ve které se syntetizuje určitá molekula, nikoli nezbytně tvorbou vazby mezi dvěma molekulami (na rozdíl od syntetázy). Syntetáza (synthetase, ligáza, ligase) je enzym, který katalyzuje tvorbu vazby mezi dvěma molekulami substrátu Syntáza vs. syntetáza

37. Enzymy s významem v medicíně lze rozdělit na • enzymy specifické pro plazmu, • buněčné enzymy a • secernované enzymy.

38. Enzymy s významem v medicíně • Enzymy specifické pro plazmu pocházejí z různých orgánů (zejména jater) a vyskytují se v aktivní formě v krevní plazmě, která je jejich místem účinku. • Patří sem například LCAT (lecitin-cholesterolacyltransferáza), koagulační enzymy (trombin, faktor XII, faktor X a další), fibrinolytické enzymy (plazminogen a jeho aktivátor) a případně také cholinesteráza • Snížení aktivity v plazmě je důsledkem poruchy sekreční aktivity orgánu (redukce intaktních buněk nebo poškození buněk).

39. Enzymy s významem v medicíně Buněčné enzymy lze rozdělit na • membránové (typicky například ACP v membránách osteoklastů nebo ALP v membránách osteoblastů), • cytosolové (ALT, LD, cytosolová AST) • mitochondriální (mitochondriální AST, CK, GMD).

40. Enzymy s významem v medicíně • Secernované enzymy reprezentují například AMS, lipáza nebo trypsinogen. Poznámka Buněčné a secernované enzymy nemají v krevní plazmě specifické funkce, do plazmy se dostávají při poruše permeability buněčné stěny, při destrukci buněk, poruše metabolismu buněk a následným uvolněním enzymu do okolí buňky.

41. Koncentrace (a tedy i koncentraci katalytické aktivity) enzymů v plazmě ovlivňují • clearance ledvinami (molekulová hmotnost enzymů obvykle neumožňuje filtraci, výjimkou je AMS, nikoli však u makroamylázémie), • clearance retikuloendotelem (Kupferovými buňkami, slezinou, kostní dření, týká se například LD5, CK-MM, cytosolové i mitochondriální AST), • lymfatická drenáž (při imobilizaci se snižuje lymfatická drenáž svalů a vzestup koncentrace enzymů v plazmě je opožděn, netýká se myokardu), • vstup enzymů do plazmatického kompartmentu (přestup přes membránu, změna produkce proliferací buněk, defekt produkce, enzymová indukce).

42. Nitrobuněčná lokalizace enzymů • cytosol nebo buněčné struktury (mitochondrie, lysosomy, buněčná membrána), na které jsou vázány. • unilokulární • solubilní enzymy cytoplazmy: LD, ALT • pouze mitochondrie: glutamátdehydrogenáza • membrány: ALP, 5'-nukleotidáza, GMT • bilokulární enzymy (cytosol i mitochondrie, odlišné molekulové formy): AST, malátdehydrogenáza

43. Patologický vzestup aktivity nebo koncentrace enzymů v plazmě • zvýšenou nabídkou enzymu z buněčných zdrojů, • sníženou rychlostí eliminace enzymu z oběhu • aktivací či uvolněním enzymu z vazby, která ho v cirkulaci blokovala

44. Patologický vzestup aktivity nebo koncentrace enzymů v plazmě a. zvýšení nabídky enzymů z buněčných zdrojů • indukce buněčné syntézy enzymů a/nebo zvýšený přestup enzymů z buňky do extracelulárního prostoru • různý stupeň poškození tkáňové buňky s dílčí poruchou permeability buněčné membrány nebo až o irreversibilní cytolýzu • vyvolávající vlivy jsou faktory infekční, imunologické, fyzikální a chemické (toxické), nutriční nebo hypoxicko-anoxické stavy • nemusí platit přímá úměra mezi intenzitou chorobného procesu a výší aktivity enzymů v plazmě (etiopatogeneze onemocnění, typ postižené tkáně a její cévní zásobení, charakter enzymu a způsob jeho clearance)

45. Patologický vzestup aktivity nebo koncentrace enzymů v plazmě b. snížená eliminace enzymů z plazmy • poruchy funkce ledvin a jater • vazba enzymů na plazmatickou bílkovinu, jako je např. tvorba makromolekulového komplexu alfa amylázy nebo kreatinkinázy s imunoglobulinem M, alfa-2 makroglobulinem apod. (zpomalená clearance enzymu) • snížená rychlost eliminace sekrečních enzymů při uzávěru přirozených vývodů exokrinních žláz (konkrementem, zánětem, tumorem) • z nashromážděného sekretu resorbují jeho složky stěnami vývodů i ve žláze samotné zpět do krve

46. Patologický vzestup aktivity nebo koncentrace enzymů v plazmě c. aktivace či uvolnění enzymu z vazby, která ho v cirkulaci blokovala • zvýšení katalytické účinnosti enzymu bez přírůstku počtu jeho molekul. Tak např. tyroxin, sekretin a cholecystokinin zvyšují aktivitu střevního isoenzymu ALP v séru. Zdá se, že fenomén aktivace sérových enzymů hormony může mít obecnější charakter.

47. Modifikace struktury a funkce buněčných enzymů(vázaných in vivo na buněčné struktury) po opuštění buňky • uvolnění do plazmy má za následek změnu konformace molekuly s ovlivněním katalytické funkce • při přechodu do extracelulárního prostředí dojde ke změnám složení a koncentrace iontů či bílkovin • důsledkem je, že tkáňový enzym v plazmě "není tím enzymem", kterým byl v buňce

48. Alkoholdehydrogenáza • EC 1.1.1.1 • CAS 9031-72-5 • Enzym ze skupiny oxidoreduktáz, katalyzující reakci  alkohol + NAD+  aldehyd + NADH + H+ etanol + NAD+  acetaldehyd + NADH + H+

49. ALT (alaninaminotransferáza) • EC 2.6.1.2, L‑alanin : 2‑oxoglutarát aminotransferasa • cytoplazmatický enzym • katalyzující přenos aminoskupiny z L‑alaninu na 2‑oxoglutarát za vzniku pyruvátu a L‑glutamátu • reakce je volně reverzibilní, uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin. • se svým koenzymem pyridoxalfosfátem se tak ALT podílí na metabolismu dusíku v organismu. • nejvíce je obsažen v hepatocytech, při poškození buňky se vyplavuje ve zvýšené míře do krve. • stanovení aktivity ALT v séru se využívá převážně k posouzení poškození jater.

50. AST (aspartátaminotransferáza) • EC 2.6.1.1, L‑aspartát : 2‑oxoglutarát aminotransferasa • buněčný enzym, vyskytující se jako cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym. • katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu • reakce je volně reverzibilní, uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin • se svým koenzymem pyridoxalfosfátem se tak AST podílí na metabolizmu dusíku v organizmu, význam má i při transportu redukčních ekvivalentů přes vnitřní mitochondriální membránu. • obsažen v myokardu, kosterním svalu a v hepatocytech • při poškození buňky se ve zvýšené míře do krve vyplavuje nejprve cytoplazmatický izoenzym, při těžkém poškození se v krvi zvyšuje i aktivita AST z mitochondrií • stanovení katalytické aktivity AST v séru se využívá hlavně k posouzení onemocnění jater, enzym nemá žádný význam pro diagnostiku poruch myokardu