Regulace transkripce u prokaryot

1. Regulace transkripce u prokaryot Regulace transkripce u prokaryot - kapitola 16 Restrikční enzymy - kapitola 5 Molekulární klonování – kapitola 4 a 5

2. Výsledek testu

3. Obecný mechanismus replikace • DNA polymeráza potřebuje RNA primer • Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp) • Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP • Ligace niků

4. DNA polymeráza III • Několik podjednotek • DnaE (-podjednotka, syntéza) • DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita) • HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu) • DnaN (-podjednotka) • Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex

5. RT PCR • Složitá manipulace s geny obsahující exony • mRNA již obsahuje sekvenci, která je translatovatelná • Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z retrovirů) vytvoření DNA z mRNA • Vytvoření jednoho vlákna cDNA – templátová DNA • Studium exprese genů

6. Regulace exprese genů • E.coli • Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000 • Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty • Změna teploty  změna exprese 50-100 genů Figure 16.1 2D Protein Gels of E. coli under Different Conditions E. coli was grown in 50 mM acetate or 20 mM formate. Three gels were run for each condition and the Figure shows a layered view of two three-gel composites. The pink and green spots are proteins induced in acetate or formate, respectively. The circled spots are those that were statistically validated, based on a pair-wise comparison of all the individual gels. (Credit: Joan L. Slonczewski and Christopher Kirkpatrick, Kenyon College, Gambier, Ohio.)

7. Regulace exprese • Jednobuněčný organismus reguluje expresi svých genů v závislosti na změně prostředí (teplota, osmolarita, zdroj látek), či vnitřních signálů (příprava na dělění apod.) • Regulace probíhá na mnoha úrovních: • Na úrovni transkripce primárního transkriptu • Na úrovni úpravy primárního transkriptu • Na úrovni stability transkriptu • Na úrovni translace • Na úrovni úpravy a sbalení peptidového řetězce do funkčního proteinu • Na úrovni kontroly aktivity proteinu • Na úrovni degradace proteinu

8. Efektivní vs rychlá regulace • Efektivní regulace je na úrovni transkriptu • Vyžaduje méně energie • Rychlá regulace je na úrovni proteinu • Protein je vždy připraven plnit svou funkci

9. Pozitivní vs negativní regulace • Negativní • Exprese genu je pozastavena dokud není represor vyvázán • Pozitivní • Gen se nepřepisuje, pokud není aktivován

10. Regulace transkripce • Na úrovni přístupu transkripčních faktorů k DNA • Důležitější u E (heterochromatin) • U P – ne až tak důležitá • Na úrovni rozeznání promotoru • U E – tři různé RNAP • U P – 1 RNAP, ale různé  faktory • Na úrovni iniciace transkripce • Nutná přítomnost aktivačních proteinů • Represor blokuje postup RNAP • Na úrovni elongace mRNA • Ne úplně běžné (zpomalení elongacem či předčasné ukončení transkripce) • Na úrovni terminace mRNA • Anti-terminator proteiny • Umožňuje transkripci genů downstream od terminátoru

11.  - faktory •  podjednotka RNAP rozeznává promotor • Alternativní  faktory

12.  Faktor tepelného šoku • Při vysoké teplotě  proteiny se špatně balí, ztrácí svou funkcí  agregují • E.coli • 37°C – OK • 43° - pořád OK • 46°C -  exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství proteinů) • Chaperony (pomáhají správně sbalit protein) • Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny) • RpoH a RpoE

13. RpoH • RpoH • 30°C – není potřebný, je rychle degradován • 42°C - protein je stabilní,  se jeho exprese • 50°C – aktivace exprese dalších heat shock genů, RpoH je posléze inaktivován • Transcripce RpoH genu je pod normálním promotorem (70 – ten je neaktivní při teplotě nad 50°C) a také pod promoterm vázající 24 (RpoE, transkripce pokračuje do 57°C, kdy RNAP je destabilizována)

14. Formace spory u Bacillus • Kaskáda alternativních  faktorů • Když je nouze o výživné látky  sporulace •  faktory důležité pro vytvoření spóry • E a K – v mateřské buňce • Pre-E – environmentální signály zapínají expresi • F a G – ve sporulující buňce • F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre-E) • G –transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre –K)

15. Formace spory u Bacillus • Kaskáda alternativních  faktorů • Když je nouze o výživné látky  sporulace •  faktory důležité pro vytvoření spóry • E a K – v mateřské buňce • Pre- E – environmentální signály zapínají expresi • F a G – ve sporulující buňce • F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre-E) • G –transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre –K)

16. Anti- a anti-anti-sigma faktory • Anti sigma faktory se vážou na  faktory a zabraňují nasednutí na promotor • SpoIIAB je anti-sigma faktorem pro F • SpoIIAA je anti-anti sigma faktorem a uvolňuje F

17. Aktivátor vs represor • Aktivátor – transkripční faktor, nutný pro expresi genu • Represor – vypíná expresi genu • U pozitivní regulace – aktivátor nutný pro zapnutí exprese • U negativní regulace – represor neumožňuje transkripci dokud není vyvázán • Indukční činidlo (inducer) • Obvykle malá signální sloučenina (živina) • váže se na regulační proteinu

18. Operon • Kluster genů pod jedním promotorem • Polycistronická mRNA • Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon – negativně regulovaný laktózový operon • Nobelova cena v roce 1965 (s Andre Lwoff)

19. Lac operon • Lac operon: • lacZ – β galaktosidáza • lacY – permeáza laktózy • lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) • LacI – represor • Upstream of lacAYZ • V opačném směru • LacO - operátor

20. Lac operon • Lac operon: • lacZ – β galaktosidáza • lacY – permeáza laktózy • lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) • LacI – represor • Upstream of lacAYZ • V opačném směru • LacO – operátor • Inducer – allo-laktóza, IPTG • Lac operon je vždy trošičku aktivní • Lac operon neni úplně standardní

21. Negativní represibilní regulace trp operonu • Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA • Represor – trpR • Opačný systém než Lac operon!

22. Negativní represibilní regulace trp operonu - atenuace • U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce • TrpL – leader 130bp • Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku • Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp • Atenuace • Není to on/off • Translace je vyladěna na přítomnost trp

23. araBAD operon • Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň • Aktivátor se obvykle váže před promotor (upstream) • Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA • Represor se obvykle váže na oblast za promotorem (downstream) • Brání vazbě RNAP na promotor • Brání posunu RNAP vpřed

24. araBAD operon • Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň (vážou se na různou oblast DNA) • AraC – regulační protein kontrolující transport a metabolism arabinózy • AraBAD (metabolismum) a AraFG (transport, uptake) operony jsou reprimovány AraC při absenci arabinózy, a aktivovány při její přítomnosti

25. Ko-represory • Některé represory jsou aktivní pouze, pokud vážou nějakou molekulu • Velmi časté u biosyntetických metabolických drah • Příklad: arginin

26. Represory vázající se na protein • Mlc • Represe genů účastnící se metabolismu glukózy • Při absenci glukózy, transporter PtsG je fosforylován • Přítomnost glukózy vede k jeho defosforylace • PtsG váže Mls • Exprese genů je spuštěna

27. Kovalentní modifikace represorů a aktivátorů • OxyR • Oxidace OxyR peroxidem vodíku • Oxiduje –SH skupiny na S-S skupiny – aktivace a vazba na DNA • Spuštění exprese genů na protekci proti oxidativnímu stresu • Fnr • Redukce Fnr spouští jeho aktivní funkci - dimerizuje (např. při anaerobních podmínkách) • Aktivace genů důležitých pro anaerobní respiraci

28. Dvousložkový regulační systém Sensor • Přidání chemické skupiny pomocí kovalentní vazby (fosfát, methyl, acetyl, AMP, ADP-riboza atd.) • 2 složky • DNA vázající protein, váže DNA pouze když je fosforylovaný (REGULATOR) • Kináza vnímavá na změny prostředí (SENSOR) • Příklady: • Nedostatek kyslíku (ArcB a ArcA) – reprimuje 20 genů, které jsou nutné pouze při aerobním metabolismu, aktivuje 6 genů nutné pro růst za anearobních podmínek • Deprivace fosfátu (PhoR a PhoB) • Metabolismus dusíku (NtrB a NtrC) Regulator

29. Globální regulace • Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu • syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním represorem • Metabolismus cukrů – globální aktivátor Crp

30. Globální regulace - Crp • Crp - cyclic AMP receptor protein • Crp zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších při absenci glukózy • cAMP je signál, že buňka má málo glukózy • Lac operon je tudíž řízen nejenom lacI, ale take Crp Cyclic AMP dimer

31. Regulační nukleotidy • Regulační nukleotidy • cAMP • cAMP je produkování adenylát cyklázou • Přítomnost glukózy inhibuje syntézu cAMP, stimuluje export cAMP ven z buňky • cGTP – vyšší organismy • c-di-GTP - důležitý pro biofilm produkující baktérie • Reguluje tranzici mezi volně-plavající a biofilm vytvářející bakterií • Produkce polymeru N-acetyl-D-glucosaminu • Biofilm umožňuje baktérií přilnout k povrchu (př. Yersinia pestis, mor, blecha) • ppGpp – kontrola hladovění u baktérií

32. Regulační nukleotidy – druhý posel Když nejsou aminokyseliny Když je glukóza Když nejsou aminokyseliny Když není glukóza

33. DNA vázající proteiny • Histone-like proteiny • Nepřímé • nespecifické • H-NS (histone-like nucleoid structuring) • 2 domény: • DNA vazebnou doménu • Protein-protein interakční doménu • Agregují (tetramery) • Vazba na A/T bohaté oblasti – reprimují expresi

34. Regulace na dálku • HU (heat unstable nucleoid protein) a IHF (integration host factor) • Pozitivní regulátory • Heterodimery • Ohýbají DNA • Pomáhají tak genovým inverzím, integracím, rekombinacím • Regulují expresi přiblížením regulačních proteinů

35. Regulace na dálku • Geny pro metabolismus dusíku • Alternativní 54 (RpoN) • Aktivátor NtrC – vazebné místo -140 bp • Aby byl umožněn kontakt s RNAP  ohyb pomocí IHF • Prokaryotický enhancer

36. Anti-terminace • Anti-terminace jako kontrolní mechanismus • Prevence terminace na specifickém místě • Transkripce pokračuje • Běžné u virů a pro některé bakteriální geny • Anti-terminační faktor se váže na RNAP před dosažením terminačního místa

37. Manipulace s DNA • Restrikční a modifikační enzymy • Nukleázy • DNA nukleázy – Dnázy • RNA nukleázy – Rnázy • Exonukleázy • Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy • Endonukleázy • ssDNA • dsDNA • Specifické (restrikční enzymy) • Nespecifické

38. Restrikční enzymy • Vyvinuty jako obrana baktérie proti cizí DNA/RNA (např. viry) • Vysoce specifické endonukleázy, rozeznávající 4 až 8 nt • Štípou obě vlákna • Mechanismus jak rozlišit svou DNA od cizí • Methylace (methylázy) adeninu, nebo cytosinu v DNA sekvenci

39. Restrikční enzymy – typ I • Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa • Reakce proběhne pouze 1x • ATP dependentní • 3 podjednotky • HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci) • HsdM – modifikační, methyluje DNA • HsdR - enzym - štípe

40. Restrikční enzymy - typ II • Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ • Dimer • Nepotřebují ATP • Potřebují kofaktor (MgCl2) • Palindrom (4 – 8 bází) • STICKY konce vs BLUNT konce

41. Restrikční enzymy – typ II • Hojně využívány v genetickém inženýrství • Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM • > několik stovek enzymů • Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů • Isoschizomery: • NarI • BbeI • EheI • KasI GGCGCC CCGCGG

42. Restrikční enzymy – typ II

43. Restrikční enzymy – typ II BamHI 5‘ NNNNNNNG 3‘ NNNNNNNCCTAG GATCCNNNNNN 3‘ GNNNNNN 5‘

44. Restrikční enzymy – typ II • Uplatnění sticky konců při klonování

45. Využití restrikčních enzymů- mapování restrikčních míst

46. Využití restrikčních enzymů- RFLP • Restriction fragment length polymorphisms • Identifikace organismu • Forénzní genetika • Určování otcovství

47. Využití restrikčních enzymů- klonování • Molekulární klonování • PCR • Ligace do PCR vektoru • Restrikční analýza • Ligace do jiných vektorů • Použití: • KNOCK-OUT • KNOCK-IN • Exprese genů - proteinů

48. PCR vektor • pGEM-T easy (Promega) • XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proABlacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

49. Modro-bílá selekce • V laboratoři při klonování • Gen je klonován do lacZ genu • X-gal • Bílé kolonie jsou pozitivní

50. Ověření úspěšnosti klonování • Namnožení pozitivních bílých baktérií • Izolace plasmidové DNA • Restrikční analýza • Agarózová gelová elektroforéza • Ethidium bromide (interkalační činidlo)